RFLP

Forum

Registrati Discussioni Recenti Preferiti Utenti Cerca Regolamento RSS Statistiche

Utilità

I libri
consigliati:

L'idea pericolosa di Darwin
Daniel C. Dennet

Scienza e ricerca: conquiste e dilemmi. L'importanza della divulgazione scientifica
Ugo Apollonio

Darwin
Jonathan Howard

Altri Libri

Nome Utente:	Password:
Riconoscimi automaticamente

Tutti i Forum

Laboratorio

Tecniche

RFLP

Nuova Discussione

Nuovo Sondaggio

Rispondi

Aggiungi ai Preferiti

Cerca nelle discussioni

Risorse di Tecniche di Laboratorio:

Didattica e Relazioni

InsideBlog

Siti Scientifici

Protocolli Laboratorio

Siti Scientifici

Ultime notizie

Aggiungi i tag

Quanto � utile/interessante questa discussione:

Autore

Discussione

lora
Nuovo Arrivato

52 Messaggi

Inserito il - 22 giugno 2009 : 17:16:35

Salve; sono in difficolt� riguardo a dei risultati ottenuti dall'analisi RFLP. Il mio scopo � quello di vedere se i campioni presentano il polimorfismo A/C o C/C nel gene p2x7 in posizione 1513. Per l'analisi ho preso come riferimento un articolo, da cui ho ordinato l'enzima di restrizione e i primers. In seguito ho ordinato un'altra coppia di primers in quanto ho dovuto lavorare, oltre che su campioni di sangue, anche su campioni paraffinati.Ho quindi preso dei primers pi� corti. A questo punto non ho avuto nessun tipo di problema per l'amplificazione e nemmeno per la digestione, infatti nei vari campioni analizzati ho trovato le bande descritte dal lavoro. Facendo un'analisi pi� accurata mi sono accorta per� che l'enzima taglia in due punti lontani dal sito del polimorfismo e addirittura fuori dalla regione amplificata dai miei primers. Come � possibile che mi vengano i frammenti giusti descritti dall'articolo?Qualcuno saprebbe darmi dei sugerimenti?Ringrazio in anticipo chiunque � in grado di aiutarmi. PS: inserisco la sequenza con il polimorfismo e i primers di interesse

1201 CCCTGGTGCAAGTGCTGTCAGCCCTGTGTGGTCAACGAATACTACTACAGGAAGAAGTGC
1261 GAGTCCATTGTGGAGCCAAAGCCGACATTAAAGTATGTGTCCTTTGTGGATGAATCCCAC
1321 ATTAGGATGGTGAACCAGCAGCTACTAGGGAGAAGTCTGCAAGATGTCAAGGGCCAAGAA
1381 GTCCCAAGACCTGCGATGGACTTCACAGATTTGTCCAGGCTGCCCCTGGCCCTCCATGAC
1441 ACACCCCCGATTCCTGGACAACCAGAGGAGATACAGCTGCTTAGAAAGGAGGCGACTCCT
1501 AGATCCAGGGATAGCCCCGTCTGGTGCCAGTGTGGAAGCTGCCTCCCATCTCAACTCCCT pol pos 1513
1561 GAGAGCCACAGGTGCCTGGAGGAGCTGTGCTGCCGGAAAAAGCCGGGGGCCTGCATCACC
1621 ACCTCAGAGCTGTTCAGGAAGCTGGTCCTGTCCAGACACGTCCTGCAGTTCCTCCTGCTC
1681 TACCAGGAGCCCTTGCTGGCGCTGGATGTGGATTCCACCAACAGCCGGCTGCGGCACTGT
1741 GCCTACAGGTGCTACGCCACCTGGCGCTTCGGCTCCCAGGACATGGCTGACTTTGCCAAC
1801 CTGCCCAGCTGCTGCCGCTGGAGGATCCGGAAAGAGTTTCCGAAGAGTGAAGGGCAGTAC
1861 AGTGGCTTCAAGAGTCCTTACTGA

TTCCTGGACAACCAGAGGAG

AGACACGTCCTGCAGTTCCT

Questi sono i primers scelti da me mantre questi

GACTCCTAGATCCAGGGATAGCC

GGAAAGAGTTTCCGAAGAGTGA sono quelli suggeruti dal lavoro

Il polimorfismo � la A evidenziata e le due sequenze riconosciute dall�enzima HhaI sono 5� GCGC 3�

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 22 giugno 2009 : 18:58:29

Devo dire che ci ho messo un po' a risolvere il mistero, risalire alla sequenza ai vari lavori ecc...
comunque mistero svelato!

Hai sbagliato a segnare la posizione in cui c'� il polimorfismo!
Quella corretta te la evidenzio qua sotto:

1201 CCCTGGTGCAAGTGCTGTCAGCCCTGTGTGGTCAACGAATACTACTACAGGAAGAAGTGC
1261 GAGTCCATTGTGGAGCCAAAGCCGACATTAAAGTATGTGTCCTTTGTGGATGAATCCCAC
1321 ATTAGGATGGTGAACCAGCAGCTACTAGGGAGAAGTCTGCAAGATGTCAAGGGCCAAGAA
1381 GTCCCAAGACCTGCGATGGACTTCACAGATTTGTCCAGGCTGCCCCTGGCCCTCCATGAC
1441 ACACCCCCGATTCCTGGACAACCAGAGGAGATACAGCTGCTTAGAAAGGAGGCGACTCCT
1501 AGATCCAGGGATAGCCCCGTCTGGTGCCAGTGTGGAAGCTGCCTCCCATCTCAACTCCCT ~~pol pos 1513~~
1561 GAGAGCCACAGGTGCCTGGAGGAGCTGTGCTGCCGGAAAAAGCCGGGGGCCTGCATCACC pol pos 1513
1621 ACCTCAGAGCTGTTCAGGAAGCTGGTCCTGTCCAGACACGTCCTGCAGTTCCTCCTGCTC
1681 TACCAGGAGCCCTTGCTGGCGCTGGATGTGGATTCCACCAACAGCCGGCTGCGGCACTGT
1741 GCCTACAGGTGCTACGCCACCTGGCGCTTCGGCTCCCAGGACATGGCTGACTTTGCCAAC
1801 CTGCCCAGCTGCTGCCGCTGGAGGATCCGGAAAGAGTTTCCGAAGAGTGAAGGGCAGTAC
1861 AGTGGCTTCAAGAGTCCTTACTGA

sinceramente non mi sono messa a guardare bene la sequenza in database e a vedere da dove inizia realmente.
Comunque da altri lavori su questo polimorfismo (quello che hai indicato tu non l'ho trovato) ho trovato che la posizione giusta � quella!
Se hai la sequenza come da database con la A non hai il sito di restrizione (GAGC), ma se hai la C allora ti salta fuori il sito di restrizione per HhaI (GCGC).
Prova a ricontrollare se cos� ti tornano i conti!

lora
Nuovo Arrivato

52 Messaggi

Inserito il - 23 giugno 2009 : 13:13:19

Non so davvero come fare a ringraziarti. Sono contenta del tuo aiuto, ora si spiega tutto, anzi i primer pi� corti per il paraffinato sembrano essere migliori rispetto agli altri. Ti auguro una buona giornata!