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silvietta82
Utente Junior
126 Messaggi |
 Inserito il - 24 giugno 2009 : 19:22:15
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Ho bisogno di un rapido ripassino di alcuni concetti:
- costrutto d'espressione con proteina di fusione
- tag nella proteina di fusione
- flag nella proteina di fusione
-espressione della proteina di fusione
Graziee
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 24 giugno 2009 : 19:32:34
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| insomma, non è che stai chiedendo proprio due cosine semplici! a parte le due domande centrali (il tag è un "marker" che viene espresso insieme alla tua proteina e che ti serve, ad esempio, per purificarla o per visualizzarla, es, un tag di istidina, il flag è un tipo di tag, cioè una sequenza specifica per la quale esistono anche anticorpi), cosa vuoi sapere dei costrutti e delle proteine di fusione? principi? protocolli? |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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silvietta82
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 24 giugno 2009 : 19:39:52
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No solo un'infarinatura di ripasso.
Per creare una proteina di fusione "prot d'interesse+tag" uso gli enzimi di restrizione?
E inserisco x es. in un plasmide prot d'interesse e tag sotto il controllo dello stesso promotore.
Trasformazione batterica per creare un alto num di copie--- Trasfezione ed espressione nelle cel d'interesse---- poi: dal lisato cell uso il tag per isolare la prot d'interesse
A questo punto: assolutamente non ho capito la differenza tra tag e flag. Il resto, seppur sintetico, ti sembra corretto?? Ti ringrazio |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 24 giugno 2009 : 19:51:57
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il flag è un tipo di tag. taggare le proteine significa marcarle. lo puoi fare in vari modi, con una serie di istidine in sequenza, con GST oppure con flag. Flag è una sequenza di 8 amminoacidi ed esistono degli anticorpi diretti contro flag.
per il resto a grandissimissime linee mi pare corretto. |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 24 giugno 2009 : 20:15:51
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Faccio solo alcune precisazioni:
Citazione:
Messaggio inserito da silvietta82
Per creare una proteina di fusione "prot d'interesse+tag" uso gli enzimi di restrizione?
Non è l'unico metodo quello di utilizzare enzimi di restrizione, ma per dire una cosa in generale diciamo di si!
Citazione:
Messaggio inserito da silvietta82
E inserisco x es. in un plasmide prot d'interesse e tag sotto il controllo dello stesso promotore.
mmm... non che sono sotto il controllo dello stesso promotore è proprio che sono fuse, hai una proteina di fusione.
In pratica hai:
- la sequenza codificante per la tua proteina senza il codone di stop seguita dalla sequenza del tag e il codone di stop, e così hai il tag al C-terminale
oppure
- il codone di inizio, la sequenza del tag seguita dalla codificante per la tua proteina (senza il codone inizio) ma con il codone di stop, così hai una tag all'N-terminale
In genere si utilizzano vettori che hanno già il tag e tu devi solo inserire la sequenza per la tua proteina.
per il resto mi sembra a posto!
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biologomolecolare84
Nuovo Arrivato
Prov.: Rm
Città: Roma
69 Messaggi |
Inserito il - 01 settembre 2011 : 10:16:24
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Ciao a tutti, in merito a questa discussione vorrei chiedere se vi è mai capitato di ottenere una proteina di fusione taggata col 3xFLAG che non funzioni più?
Mi spiego meglio: ho una proteina di 241 aa il cui mRNA viene trascritto sullo stampo di una sequenza eterocromatica del cromosoma 2 di drosophila. Ho provato a taggarla con la GFP (238 aa) ma i mutanti nulli non recuperano il fenotipo (la mancanza della proteina provoca la morte al terzo stadio larvale). Ho pensato che la quasi uguaglianza di dimensioni della GFP con la mia proteina poteva disturbarne il folding e quindi renderla inattiva. Ho provato allora a taggarla con il 3xFLAG: stesso risultato.
Quando faccio il WB contro il FLAG, la proteina è presente, ciò sta ad indicare che le iniezioni sono state eseguite correttamente!
E' possibile che un tag così piccolo (credo di circa 23 aa) possa davvero disturbarla?
Grazie a tutti. |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 01 settembre 2011 : 10:46:38
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| hai provato a costruire costrutti con la modificazione o N-terminale o C-terminale? Se la stai modificando sempre su uno stesso punto, magari un particolare dominio funzionale o prossimo a un dominio sensibile, probabilmente ne modifichi funzione/sorting/localizzazione etc |
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biologomolecolare84
Nuovo Arrivato
Prov.: Rm
Città: Roma
69 Messaggi |
Inserito il - 01 settembre 2011 : 11:04:02
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si certo...ho pensato pure a questo...il dominio conservato è al C-terminale, quindi credo che sia quello più importante per la funzione , anche se ciò non mi dà nessuna certezza per quanto riguarda l'N terminale, dove ho quindi inserito il 3xFlag. Ma conoscete casi in cui un tag così piccolo è in grado di disturbare la proteina di interesse?
Se fosse così, che dovrei fare? L'unica scelta sarebbe quella di farmi produrre l'anticorpo contro la proteina, il problema è che, volendo caratterizzarla dal punto di vista funzionale, avevo pensato di spezzare il dominio C-term dall'N e saggiarli per il recupero del fenotipo in modo da restringere la sequenza fondamentale per la funzione, ancora ignota, della mia proteina.Grazie ancora per l'aiuto. |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 01 settembre 2011 : 11:20:00
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| La certezza che il tuo Flag disturbi o meno la funzione della tua proteina non te la da nessuno, lo puoi sapere solo sperimentando i vari costrutti di fusione. Che localizzazione ha la tua proteina? Sei sicuro che il flag non la disturbi? |
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biologomolecolare84
Nuovo Arrivato
Prov.: Rm
Città: Roma
69 Messaggi |
Inserito il - 01 settembre 2011 : 13:03:38
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| Abbiamo fatto degli esperimenti di immunofluorescenza e abbiamo visto che anche se GFP-proteina non recupera il fenotipo, localizza sui cromosomi politenici. L'IF contro il FLAG fuso alla stessa proteina non da segnale...ma ciò potrebbe essere dovuto al fatto che magari l'Ab contro il flag funziona bene per WB e non per IF. Mi sembra improbabile che la GFP (molto più grande del flag) non ha alcun effetto sulla normale localizzazione della proteina, mentre il flag la influenza; comunque non è da escludere, è vero. Come costrutti ho solo flag e GFP (ad entrambe le estremità), dovrei provare a taggare con 6xHis che è ancora più piccolo? |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 01 settembre 2011 : 13:18:05
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| beh, potresti provare ma a questo punto personalmente escluderei che sia una questione di dimensione dell'epitopo. Se nn erro hai detto che vedi la proteina in w.b., quindi direi che è espressa correttamente e non degradata. E' abbondante? |
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biologomolecolare84
Nuovo Arrivato
Prov.: Rm
Città: Roma
69 Messaggi |
Inserito il - 01 settembre 2011 : 13:21:17
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| beh si...una banda discreta...il costrutto è corretto perchè è stato sequenziato. Non so cosa pensare...Grazie, davvero. |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 01 settembre 2011 : 14:08:50
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| Beh di nulla, non credo di esserti stato molto di aiuto. Tornando al costrutto proteina-GFP, dicevi che per IF localizza nei cromosomi politenici? Sai se è questa la sua corretta localizzazione? Esistono anticorpi diretti contro questa proteina? Potrebbe essere che la GFP non ne influenza la localizzazione, ma solo la funzione e per questo non hai rescue del fenotipo mutante. Quanto linker hai messo tra la tua proteina e la GFP? (il linker è quella sequenza di aa che intercorre tra la sequenza codificante la tua proteina e la sequenza GFP). |
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biologomolecolare84
Nuovo Arrivato
Prov.: Rm
Città: Roma
69 Messaggi |
Inserito il - 01 settembre 2011 : 14:25:47
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Purtroppo non esiste un anticorpo contro questa proteina, pensiamo che localizzi sui cromosomi solo perchè vediamo GFP-proteina...non abbiamo mai visto solo la proteina, in quanto non c'è l'anticorpo. Certo è quello che ho pensato anche io: la GFP può non disturbare la localizzazione ma solo la funzione, pertanto non c'è rescue. Adesso non so bene quanto è lungo il linker (il costrutto con la GFP è stato fatto da una persona che non lavora più qui), io mi sono occupato di fare i costrutti col flag (ho anche i costrutti tronchi ma se non ho rescue con l'intero non serve a nulla provare con i tronchi).
Mi sa che a questo punto mi conviene farmi produrre i diversi anticorpi.
Grazie ancora. |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 01 settembre 2011 : 14:34:21
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beh, in effetti avere l'anticorpo diretto contro la proteina endogena ti servirebbe anche da controllo. Per quanto riguarda il Flag, potresti ripetere le immunofluorescenze variando fattori come fissazione, conc. anticorpo ecc e vedere se risolvi la situazione. Potresti anche usare un altro stock di anti-Flag, magari il tuo non è adatto per le IF.
In questo momento non so dirti altro, ma se mi viene in mente qualcosa non mancherò di fartelo sapere.
buona fortuna! |
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biologomolecolare84
Nuovo Arrivato
Prov.: Rm
Città: Roma
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Inserito il - 01 settembre 2011 : 14:45:14
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Grazie davvero, sei stato gentilissimo.
Ciao. |
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tag, flag e proteine di fusione
Didattica
