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Ika
Nuovo Arrivato

Prov.: Isernia
Città: Carovilli


9 Messaggi

Inserito il - 25 giugno 2009 : 18:49:41  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Ika  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Ika Invia a Ika un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti!
Sto facendo la revisione di un articolo che parla della Real Time sui miRNA...il problema è che io non ho mai lavorato nè con i miRNA nè tantomeno con la Real Time!
In questo articolo hanno utilizzato come unico controllo un RNA nucleolare, RNU49, ma io non ho trovato altri lavori in cui l'hanno utilizzato.

Qualcuno di voi saprebbe dirmi se si utilizza RNU49 come controllo e quali sono normalmente i controlli utilizzati per RealTime sui miRNA!

Un'altra domandina..: non sarebbe meglio utilizzarne più di uno?

Grazie a tutti!!!
Ciao!

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi

Inserito il - 25 giugno 2009 : 19:11:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Ika

Qualcuno di voi saprebbe dirmi se si utilizza RNU49 come controllo

si si può utilizzare come controllo, e direi che non dovrebbe andare male come tipo di controllo.
Citazione:
Messaggio inserito da Ika

hanno utilizzato come unico controllo un RNA nucleolare, RNU49, ma io non ho trovato altri lavori in cui l'hanno utilizzato.

Ce ne sono, eccone ad es. due:
MicroRNAs Differentially Expressed in ACTH-Secreting Pituitary Tumors
Integrated Genomic Profiling of Chronic Lymphocytic Leukemia Identifies Subtypes of Deletion 13q14

Citazione:
Messaggio inserito da Ika

quali sono normalmente i controlli utilizzati per RealTime sui miRNA

Il più utilizzato credo sia U6, viene spesso utilizzato anche 5S (anche se non è tanto piccolo) ma ho visto anche una marea di lavori in cui utilizzano addirittura GAPDH!!! Anche se a mio avviso non è certo il controllo "adeguato".

Citazione:
Messaggio inserito da Ika

Un'altra domandina..: non sarebbe meglio utilizzarne più di uno?

si sarebbe meglio! Come in tutte le real-time, il numero minimo sarebbe 3 housekeeping.... ma lo fanno in pochi!
Quindi in sostanza, puoi farla notare come cosa ma non può essere un fattore limitante all'accettazione del lavoro.

Spero di aver chiarito tutto

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Flashtgm
Nuovo Arrivato



17 Messaggi

Inserito il - 26 giugno 2009 : 15:39:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Flashtgm Invia a Flashtgm un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Nel nostro laboratorio il GAPDH lo utilizziamo regolarmente come controllo in procedure di silenziamento genico tramite siRNA. E' un gene housekeeping che non dovrebbe risentire di particolari interazioni con altri geni...che ha che non va?
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi

Inserito il - 26 giugno 2009 : 15:59:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Flashtgm

Nel nostro laboratorio il GAPDH lo utilizziamo regolarmente come controllo in procedure di silenziamento genico tramite siRNA. E' un gene housekeeping che non dovrebbe risentire di particolari interazioni con altri geni...che ha che non va?

A parte le considerazioni personali che ho fatto su GAPDH in altre discussioni e il fatto che secondo me (non solo secondo me c'è molta letteratura al riguardo!) bisognerebbe utilizzare 3 housekeeping e per sceglierli bisognerebbe valutare "prima" se siano veramente stabili in tutte le condizioni dell'esperimento.

Comunque qua si stava parlando di miRNA e di HK per miRNA, GAPDH non è un "piccolo" RNA e quindi non è "adeguato" come controllo in studi di miRNA.
Poi nessuno ti vieta di utilizzarlo, visto che comunque è utilizzato da molti e ho visto pubblicazioni anche su giornali con IF elevati.
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Flashtgm
Nuovo Arrivato



17 Messaggi

Inserito il - 26 giugno 2009 : 16:09:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Flashtgm Invia a Flashtgm un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
A rischio di dire una fesseria, il GAPDH potrebbe essere un buon controllo anche lavorando con miRNA, a patto che le procedure di estrazione riguardino tutto l'RNA cellulare (compreso le piccole molecole single strand ad hairpin come i mIRNA). E' chiaro che se estrai selettivamente solo i miRNA (ad es. con un kit del tipo miRVANA), controllare il GAPDH è una perdita di tempo.
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi

Inserito il - 26 giugno 2009 : 16:21:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Guarda non è che lo dico io, ma quelli che studiano i miRNA (intendo i luminari del campo). E in effetti ha senso utilizzare come controllo qualcosa di "simile", anche come livello di espressione.
Se studi un RNA poco espresso sarebbe più corretto utilizzare anche un HK poco espresso.
Comunque facendo una ricerca in PubMed per Real-Time e housekeeping trovi molti articoli interessanti.

N.B. scusa una piccola precisazione:
Citazione:
(compreso le piccole molecole single strand ad hairpin come i mIRNA)

i miRNA non sono hairpin, sono i precursori pre-miRNA che sono hairpin!
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Flashtgm
Nuovo Arrivato



17 Messaggi

Inserito il - 26 giugno 2009 : 16:33:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Flashtgm Invia a Flashtgm un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da GFPina

Guarda non è che lo dico io, ma quelli che studiano i miRNA (intendo i luminari del campo). E in effetti ha senso utilizzare come controllo qualcosa di "simile", anche come livello di espressione.
Se studi un RNA poco espresso sarebbe più corretto utilizzare anche un HK poco espresso.
Comunque facendo una ricerca in PubMed per Real-Time e housekeeping trovi molti articoli interessanti.

N.B. scusa una piccola precisazione:
Citazione:
(compreso le piccole molecole single strand ad hairpin come i mIRNA)

i miRNA non sono hairpin, sono i precursori pre-miRNA che sono hairpin!



Ops, hai ragione
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amicia
Nuovo Arrivato



24 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2009 : 08:24:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di amicia Invia a amicia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti,
forse l'articolo di Joe Vandesomple può aiutare ika. Mi sembra che sia particolarmente centrato sulle domande che poneva:
http://real-time-pcr.blogspot.com/
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Ika
Nuovo Arrivato

Prov.: Isernia
Città: Carovilli


9 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2009 : 13:40:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Ika  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Ika Invia a Ika un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Tante grazie a tutti!
Mi siete stati utilissimi!!!
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