| Autore |
Discussione |
|
|
milagros
Nuovo Arrivato
13 Messaggi |
 Inserito il - 13 aprile 2006 : 01:15:50
|
|
per effettuare un dosaggio enzimatico si deve considerare la quantità di substrato scomparsa o più semplicemente quella del prodotto formatasi.ma praticamente,ovvero sei io sono in un lab come facio a fare un dosaggio enzimatico?????qualcuno mi spiega passaggio per passaggio il processo.grazie .....ah nel caso specifico se si volesse dosare l'atpasi???
|
|
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 13 aprile 2006 : 02:37:19
|
Beh, dipende ovviamente dall'enzima!
In generale devi avere un saggio che ti permette di dosare il substrato o il prodotto.
Ad esempio immagina che il tuo enzima sia in grado di trasformare un substrato incolore in un substrato blu puoi procedere così:
1) metti la stessa quantità, ad es. 1 mmol, di substrato in 10 provette
2) aggiungi quantità note di enzima alle provette (es. 0.1 U nella prima provetta, 0.2 nella seconda, 0.5 nella terza, poi 1, 2, 5, 10 etc.)
3) aspetti il tempo necessario perchè la reazione avvenga (eventualmente dovrai aggiungere qualche reagente o cambiare la temperatura a seconda dell'enzima)
4) misuri con uno spettrofotometro l'assorbanza dei vari campioni ad una opportuna lunghezza d'onda, ad es. attorno ai 500nm se il prodotto è blu.
5) fai una retta di taratura con i punti ottenuti, quindi metti in grafico l'assorbanza vs. le unità enzimatiche.
6) finalmente puoi fare il tuo saggio: prendi 1 mmol di enzima (o quanto ne avevi messo nello standard) e aggiungi il tuo campione contenente x unità di enzima. Poi vai a leggere l'assorbanza e vedi dove si trova sulla retta di taratura e puoi estrapolare la quantità di enzima nel tuo campione!
-----
Per l'ATPasi, ad es. si può usare PEP (fosfoenolpiruvato) che viene convertito a piruvato. Mettendo anche NADH e LDH (lattico deidrogenasi) puoi misurare lo shift di assorbanza del NADH che viene ossidato a NAD+ (da 340 a 260 nm) dalla LDH
Alternativamente puoi usare gamma32P-ATP e misurare la radioattività residua su filtro dopo il trattamento con l'enzima. |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
 |
|
|
milagros
Nuovo Arrivato
13 Messaggi |
Inserito il - 13 aprile 2006 : 11:13:57
|
| grazie mille.la descrizione è stata davvero esauriente.una sola domanda ancora.....potresti spiegarmi ancora meglio il punto 6???grazie mile |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 13 aprile 2006 : 21:36:01
|
beh, i passaggi pratici sono gli stessi che usi per fare la tua retta di taratura, solo che invece di mettere una quantita' nota di enzima metti il tuo campione in cui non sai quanto enzima c'e'.
Ora, supponiamo che il tuo standard ti abbia dato come risultati
Enzima Assorbanza
0.1 0.06
0.2 0.09
0.5 0.23
1 0.53
2 1.03
5 2.46
10 5.01
Fai una retta di regressione (che a occhio viene y=0.5x)
Poi leggi l'assorbanza del tuo campione: viene 0.8
Vai sul grafico, prendi il punto della retta con y=0.8 e vedi a che x corrisponde (o la ricavi dall'equazione). In questo caso verra' 1.6.
Spero che cosi sia piu chiaro,
Ciao! |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
kORdA
Utente Attivo
Prov.: Milano
Città: Monza
1303 Messaggi |
Inserito il - 14 aprile 2006 : 09:52:46
|
Per costruire la retta di taratura devi adottare il famosissimo metodo dei minimi quadrati.
Se rilevi che il campione è troppo concentrato (ai margini dell'intervallo di linearità) è meglio diluirlo. Trovarsi ai limiti dell'intervallo di linearità non è mai buona cosa; tanto più che nelle misure di assorbanza potrebbe intervenire l'effetto Job.
In quest'ultimo caso la curva di taratura non sarà più una retta, bensì una curva logaritmica. Vale la pena allora diluire il campione e riportarsi sull'intervallo di linearità, piuttosto che interpolare i dati con una logaritmica. |
http://www.linkedin.com/in/dariocorrada |
|
|
|
milagros
Nuovo Arrivato
13 Messaggi |
Inserito il - 14 aprile 2006 : 22:06:03
|
....  allora.......mi sono persa......ma cos'è un areta di taratura?????cioè....prendo 10 provette,in ognuna ci metto 1mmol di sub,poi ci aggiungo una quantità diversa di enzima in ognuna......misuro l'assorbanza allo spettrofotometro,faccio un grafico in cui riporto lunghezza d'onda e concentrazione di enzima (le rispettive che ho aggiunto nelle provette) e poi??????da qui non capisco.......
poi....perl'atpasi.....es
in provetta ci metto 1 mmol di PEP ,nella stessa provetta aggiungo stessa quantità di lattico deidrogenasi?????
Dopo poi misuro l'assorbanza allo spetrofotometro e poichè so che l'nadh ha un certo range di assorbanza......ma poi come mi ricavo la concentrazione di enzima o di substarto?????
sono troppo dubbiosa.....grazie |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 16 aprile 2006 : 13:52:59
|
Allora, vediamo di chiarire un po' di dubbi!
1) retta di taratura
il tuo grafico lo fai con assorbanza (non lunghezza d'onda, quella e' fissa) sulle y e concentrazione sulle x.
Quindi hai ad es. 10 punti che, se sono piu o meno come nel mio esempio sopra seguono piu o meno l'andamento di una retta, che viene chiamata retta di taratura. Per trovare l'equazione della retta si fa una regressione lineare, solitamente usando il metodo dei minimi quadrati, come giustamente ha detto kORdA.
Ora, tu hai questa retta, come in questa figura
Questa adesso ti serve come riferimento, perche' tu vorrai misurare un certo campione contenente una quantita' non nota di enzima
Quindi se il tuo campione ha assorbanza 3 tu puoi andare sul grafico e trovare che punto della retta ha quell'assorbanza, in questo caso circa 6 (se usi l'equazione precisa della retta avrai un risultato piu preciso).
Quindi puoi dire che il tuo campione conteneva 6 unita' di enzima.
2) per l'ATPasi, la misura con il NADH e' una misura indiretta, nel senso che tu misuri un cofattore di un enzima che agisce sul prodotto del tuo enzima. Anche qui, non e' importante quanta LDH metti, perche' se stai nelle stesse condizioni in cui hai misurato i campioni per fare la retta di taratura sei a posto: nel tuo grafico avrai l'assorbanza del NADH (o del NAD) contro la concentrazione di ATPasi, mantenendo fissa la concentrazione di LDH.
In generale cmq io metterei LDH in eccesso, in modo che tutto il piruvato sia immediatamente convertito in lattato.
|
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
kORdA
Utente Attivo
Prov.: Milano
Città: Monza
1303 Messaggi |
Inserito il - 16 aprile 2006 : 15:16:47
|
mannaggia chick80, mi hai battuto sul tempo...
comunque io posto lo stesso , se non altro per aggiungere ulteriore confusione nella testa di milagros
scheeeeerso! comunque...
La retta di taratura e' una retta che passa il piu' vicino possibile ai tuoi punti senza toccarli (i punti li ottieni da un grafico in cui correli la quantita' nota di enzima all'assorbanza). Tale retta ti serve appunto per estrapolare la quantita' incognita dell'enzima partendo dalla misurazione di un'assorbanza.
L'equazione di tale retta si ottiene applicando il metodo dei minimi quadrati. Non e' necessario pero' mettersi dietro con carta e penna, ma se proprio insisti vai a guardarti http://it.wikipedia.org/wiki/Metodo_dei_minimi_quadrati oppure http://it.wikipedia.org/wiki/Minimi_Quadrati; ad ogni modo se butti dentro i tuoi dati in un foglio di excel puoi ottenere in automatico la retta e ricavarti pure il coefficiente angolare e l'intersezione a x=0 ( ricordo l'equazione della retta y=ax+b )
Il dosaggio che ha illustrato chick80 si basa sull'interconversione NAD+/NADH. Sia la forma ossidata sia la forma ridotta di questo dinulcleotide assorbono a 260nm, ma solo la forma ridotta assorbe a 340nm. L'ATPasi e' un enzima che non utilizza ne' NAD+ ne' tantomeno NADH; tuttavia tale enzima può essere dosato accoppiandolo con l'attivita' della LDH. La catena globale di reazioni può venire schamatizzata cosi:
1) PEP + ADP ---ATPasi---> piruvato + ATP
2) piruvato + NADH ---LDH---> lattato + NAD+
La miscela di dosaggio deve contenere fosfato, ADP, PEP e LDH e NADH in ecccesso di modo che l'ATPasi da dosare sia il fattore limitante della catena di reazioni. Il numero di unita' di enzima presente nel campione viene poi calcolato in base alla seguente formula:
unità di attività enzimatica (quantita’ necessaria per convertire 1 micromole di substrato in prodotto in un minuto) = DEa/edn
DE (delta E) rappresenta la variazione di assorbanza a 340nm dal controllo entro 1min
e (epsilon) e' il coefficiente di estinzione molare per il NADH
a e' il volume totale della miscela di dosaggio
n e' il coefficiente stechiometrico
d e' il cammino ottico
Dividendo il tutto per la concentrazione totale di proteine presenti nel campione ottieni l'attività specifica dell'enzima.  |
http://www.linkedin.com/in/dariocorrada |
|
|
|
milagros
Nuovo Arrivato
13 Messaggi |
Inserito il - 21 aprile 2006 : 17:58:08
|
bene..tutto molto chiaro......
però dovete aiutarmi ancora...
misurare la concentrazione tramite la legge di Lambert -Beer
A= - log di T
T= 10 (alla meno) abc
per cui A= abc
dove a=assorbanza specifica
b=cammino ottico (di solito 1 cm)
c=concentrazione
ora per conoscere quella c ,mi serve sapere A ed assorbanza specifica,giusto???
ma l'assorbanza specifica di NADH per es è 340 nm???
|
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 22 aprile 2006 : 01:11:14
|
No, quella e' semplicemente la lunghezza d'onda a cui fai la misura.
La legge si dovrebbe infatti scrivere piu correttamente come Alambda = alambdabc
Es. per il NADH A340= a340bc
Questo perche' tu puoi anche fare l'esperimento misurando a 360 nm, o a 290... ma il risultato sara' molto meno accurato tanto piu ti allontani da quel 340 che e' la lunghezza d'onda a cui il NADH ha la sua massima assorbanza, ed inoltre potresti avere altre sostanze che assorbono ad altre lunghezza d'onda.
Detto questo, l'assorbanza specifica, spesso indicata come coefficiente di estinzione molare e indicata con la lettera greca epsilon e' l'assorbanza di una soluzione 1M del composto puro in condizioni standard. Nel nostro caso quindi sarebbe l'assorbanza, misurata a 340nm e a 37 gradi e 1 atm, di una soluzione 1M di NADH.
In generale il valore di epsilon si considera costante, anche se in realta' dipende dalla temperatura (e credo anche dalla pressione).
Per il NADH a 340nm vale 6.22 l/(mol*cm) (nota che l'assorbanza e' un numero puro, non ha unita' di misura!) |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
nyroca
Nuovo Arrivato
Città: Bologna
1 Messaggi |
Inserito il - 28 maggio 2007 : 11:29:46
|
| Salve a tutti volevo chiedere come come si fa a verificare da un grafico assorbanza tempo se l'enzima segue Michaelis-Menten. |
|
|
|
Pierdomenico
Nuovo Arrivato
Prov.: L'Aquila
Città: L'Aquila
11 Messaggi |
|
|
hurricane86
Nuovo Arrivato
50 Messaggi |
Inserito il - 21 febbraio 2008 : 19:57:45
|
ciao a tutti ragazzi, ho un problema con il calcolo dell'attività nel saggio enzimatico,spero possiate aiutarmi
lo stesso interrogativo si può risolvere con la retta di taratura e fino a qui ci sono,
ma esite il metodo attraverso la legge di lamber beer,(unico utilizzabile se non hai marker noti per fare la taratura) dopo aver trovato la differenza di concentrazione in micromol/microlitro*min come rapporto questo risultato al volume totale?
si capisce quello che chiedo??
|
Think I'll lose my mind if I don't find something to pacify
....muore lentamente chi non esplora cio che non conosce.... |
|
|
|
Ale SS
Nuovo Arrivato
Prov.: Sassari
31 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2008 : 19:22:22
|
Ciao a tutti...
non vorrei essere ripetitiva facendo le stesse domande, però non riesco a capire alcune cose:
Qui sopra è spiegato benissimo come trovare la concentrazione del mio campione costruendo la retta di taratura, io questo procedimento lo eseguito anche in laboratorio con quello che si chiama "metodo diretto di bredford" per il dosaggio della proteina BSA, e nei miei appunti è spiegato nel paragrafo che parla del dosaggio dei metaboliti.
Per quanto riguarda i dosaggi enzimatici, mi parla di calcolare l'attività di un enzima seguendo il cambiamento di A nel tempo, inoltre questo tipo di dosaggio può essere diretto o indiretto, quest'ultimo se blocco la reazione per aggiungere dei cromofori.
Alla fine dovrei arrivare a calcolare l'unita enzimatica.
Come faccio ...potete spiegarmi meglio tutti i passaggi
grazie mille
|
|
|
|
ale83t
Nuovo Arrivato
Prov.: Ferrara
Città: Ferrara
21 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2008 : 15:13:31
|
Ciao!
allora, innanzitutto per calcolare l'attività enzimatica in U/l potresti fare anche a meno di fare una retta di taratura, soprattutto se non possiedi un enzima standard su cui basarti. Occhio però: devi sapere il coefficiente di estinzione molare del tuo prodotto o substrato per ottenere le U/l, altrimenti puoi ottenere un valore di unità enzimatiche anche senza sapere l'epsilon, ma saranno tipo delle unità arbitrarie di enzima...
Una volta che hai fatto il tuo dosaggio enzimatico (meglio se endpoint = blocchi la reazione enzimatica dopo un tot di tempo) leggi la miscela ed il BIANCO DI REAZIONE allo spettrofotometro. In questo modo ottieni l'assorbanza dovuta allo sviluppo di un prodotto o al consumo di un substrato, nonchè l'assorbanza della tua reazione senza l'enzima (il substrato potrebbe subire una autolisi durante l'incubazione ed inoltre i tamponi di reazione assorbono sempre qualcosina...).
Quello che devi fare è ottenere il delta Assorbanza ( A campione - A bianco).
Una volta fatto questo, c'è una formuletta da seguire ed è questa:
U/l = (Delta A * 1000 * V)/ (epsilon * t * d * v)
Adesso ti spiego i termini della formula:
Delta A = A campione - A bianco.
1000 = per rapportare la concentrazione ad 1 litro.
V = volume della miscela di reazione (in ml)
epsilon = coefficiente di estinzione molare
t = tempo in minuti della reazione
d = cammino ottico in centimetri (comunque di solito è 1)
v = volume del campione (in ml)
In questo modo dovresti ottenere le U/l di enzima presenti nel tuo campione oppure ti puoi calcolare le U/ml...spero di essere stato chiaro...
|
|
|
|
Ale SS
Nuovo Arrivato
Prov.: Sassari
31 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2008 : 16:11:40
|
Non ci sono molto...
Allora per esempio la reazione è: ADENOSINA -----> INOSINA
lungh. d'onda= 265
delta epsilon= 6,39
l'esempio mi dice che è stato trasformato tutto il substrato in prodotto per via enzimatica (dunque aggiungo il mio enzima)e calcolo l'attività enzimatica
Le pendenze (cioè pendenze?  ) così misurate rappresentano la variazione di A al minuto
quindi delta A / delta T
Per la legge di lambert-beer giustamente diventa: delta A / delta T = delta Epsilon * delta C/ delta T
...alla fine: delta C / delta T = delta A / delta T * 1/ delta epsilon così dovrei aver ricavato l'unita enzimatica
forse devo semplicemente calcolare l'assorbanza del prodotto che ottengo senza l'enzima e poi dopo aver aggiunto l'enzima quindi a reazione catalizzata, ho il delta A, il delta epsilon è tabulato, posso calcolarmi la concentrazione dell'enzima che mi è servita per trasformare il substrato in prodotto...giusto?
grazie per la pazienza...
|
|
|
|
ale83t
Nuovo Arrivato
Prov.: Ferrara
Città: Ferrara
21 Messaggi |
Inserito il - 12 giugno 2008 : 11:08:38
|
puntualizzo una cosa: di solito in un dosaggio enzimatico il substrato non viene mai consumato tutto.
Un'altra precisazione: si parla di epsilon e non di delta epsilon di solito...
Allora, da quanto ho capito tu hai in un grafico la variazione dell'assorbanza in funzione del tempo: se è così allora la pendenza rappresenta la variazione di assorbanza al minuto, quindi delta A/minuto.
Da qui i conti sono giusti: usando la legge di Lambert-Beer ottieni che C = delta A / (epsilon * t), ma le unità enzimatiche sono di solito riferite o al litro (o ml) o al mg di proteine (ed in questo caso si parla di attività specifica), è per questo che nella formula che ho messo prima entrano in gioco anche i volumi della reazione e del campione...perchè non devi dimenticarti che tu metti un certo volume noto di campione e quindi l'attività che trovi è riferita al tuo volume, non è una unità che può essere confrontata tra diversi campioni...
Infine, può andar bene quello che hai detto te qui:
Citazione:
forse devo semplicemente calcolare l'assorbanza del prodotto che ottengo senza l'enzima e poi dopo aver aggiunto l'enzima quindi a reazione catalizzata, ho il delta A, il delta epsilon è tabulato, posso calcolarmi la concentrazione dell'enzima che mi è servita per trasformare il substrato in prodotto...giusto?
però devi sempre ricordarti di riferire ciò che ottieni al litro o ml o mg di proteine....spero di esserti stato di aiuto... |
|
|
|
Ale SS
Nuovo Arrivato
Prov.: Sassari
31 Messaggi |
Inserito il - 13 giugno 2008 : 09:13:19
|
ok grazie tante...ora mi è chiaro!
|
|
|
|
aarieel
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
 Inserito il - 03 novembre 2010 : 21:19:35
|
ragazzi a proposito di dosaggio dell' attività enzimatica sapreste spiegarmi come faccio a dosare l'attività enzimatica della cyt c ossidasi mediante l'utilizzo dell'ossigrafo? ( si fa riferimento alla misurazione indiretta della concentrazione dell'ossigeno )
Grazie a tutti per lo splendido lavoro che fate |
|
|
|
Marshepherd
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
Inserito il - 15 novembre 2013 : 19:57:45
|
Ciao a tutti, sto studiando gli enzimi, il dosaggio enzimatico, ecc..
e credo che sto facendo un Po di confusione:
allora, poiché quando andiamo a fare un dosaggio enzimatico la quantità di substrato va via via diminuendo viene ricavata la velocità iniziale v0, ok
per ricavarla possiamo usare o un metodo analitico, tracciando la tangente alla curva del grafico o matematicamente con l'equazione di michelis, ok mi sono perso!!
a cosa mi serve in realtà questa v0? Se io voglio vedere come varia la concentrazione di NADH a cosa mi serve la v0? Che valore ottengo? E soprattutto cosa ottengo? Ok traccio la retta tangente ma on un grafico y : concentrazione e x: tempo che valore mi da?
e poi che relazione c'è fra v0 e grafico di michelis?
ragazzi vi prego datemi una mano! |
|
|
|
Mety
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 27 febbraio 2014 : 11:43:18
|
| scusatemi se mi intrometto,ma avrei una piccola domanda: una volta che ottego i miei valori di mU/mL come faccio a trasformarli in mM/mL? |
|
|
| |
Discussione |
|
dosaggio enzimatico
Didattica
Inserito il - 07 giugno 2007 : 16:32:05
Cinetica enzimatica in Stato Stazionario può servirti.doc
