Forum

Nome Utente:
Password:
Riconoscimi automaticamente
 Tutti i Forum
 Laboratorio
 Biologia Molecolare
 efficienza oltre il top in real time
 Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
I seguenti utenti stanno leggendo questo Forum Qui c'è:

Aggiungi Tag Aggiungi i tag

Quanto è utile/interessante questa discussione:

Autore Discussione  

cin
Utente Junior

ptero
Prov.: Padova
Città: Padova


558 Messaggi

Inserito il - 18 aprile 2006 : 14:07:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Vi è mai capitato di avere l'efficienza di una reazione di real time superiore al massimo? Sapreste darmi una spiegazione del perchè, di come sia possibile essere più efficienti del valore massimo? Riesco a comprendere le cause di una bassa efficienza, ma il contrario no.
Grasssie

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 19 aprile 2006 : 04:09:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Cosa intendi esattamente per efficienza?

Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui

My photo portfolio (now on G+!)
Torna all'inizio della Pagina

cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
Città: Padova


558 Messaggi

Inserito il - 19 aprile 2006 : 14:14:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Pensavo che tutti si esprimessero in questi termini.
Lavoro con il Syber Green e con l'OPTICON 2 dell'MJ.
Quando ho valori di questo genere sopra la retta standard:
C(T) Control Graph Y=-0.30x +9.83;r^2=0.994
e i vari punti della retta sono distanziati in maniera corretta,
siamo al massimo dell'efficienza.

Quando ho valori di questo genere:
C(T) Control Graph Y=-0.35x + 14.18; r^2=0.992
siamo oltre il massimo dell'efficienza

Quando ho valori di questo genere:
Y=-0.24x+ 10.16; r^2=0.994
abbiamo una bassa efficienza

ovvero ho una massima efficienza con valori
di Y= -0.30

Volevo inserire un grafico per far capire meglio,
ma non mi è possibile, perchè quando la real sta andando
non riesce a fare nient'altro. Appena posso lo farò.
Spero di essermi spiegata, ma son sicura di no
Ciao

Torna all'inizio della Pagina

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 19 aprile 2006 : 15:51:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ah ok... ho sempre lavorato con TaqMan, non ho mai usato il SYBR Green e' per quello che non mi tornava! :D

Comunque credo che il problema sia puramente matematico. L'equazione che ottieni e' una retta interpolata da un certo numero di punti suppongo, quindi e' un risultato che approssima l'andamento della situazione, e a volte puo' darti risultati al di sopra del massimo.
Questa ovviamente e' una mia supposizione... ripeto non ho mai usato il SYBR Green

Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui

My photo portfolio (now on G+!)
Torna all'inizio della Pagina

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 02 maggio 2006 : 16:03:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao!
Io sto iniziando ad utilizzare la Real Time con il sybr Green... non sono un'esperte perchè sono agli inizi, ma ho da poco seguito il corso per l'utilizzo dello strumento e spulciando i miei appunti ho trovato la risposta alla tua domanda:

Se ho una E>100% può essere che ho dei primers non specifici e sto amplificando qualche cos'altro oltre al mio templato, oppure può essere dovuto ad un errore sistematico (x. es pipetta starata) se è del 2-5% maggiore del massimo.
Comunque una efficienza tra 95-105% è buona!

Questo è quello che ho trovato.
In effetti l'efficienza è la pendenza della curva, quindi penso che chik80 abbia ragione.

Ciao
Torna all'inizio della Pagina

cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
Città: Padova


558 Messaggi

Inserito il - 02 maggio 2006 : 16:30:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie ad entrambi, ne parleremo alla riunione di lab e vediamo cosa ne verrà fuori.
Torna all'inizio della Pagina

Cangrande
Utente Junior

Cangrande Della Scala

Prov.: Verona


280 Messaggi

Inserito il - 03 maggio 2006 : 10:57:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Cangrande Invia a Cangrande un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Hai provato a fare un pcr prova facendola poi correreb su gel d'agarosio 2%. Così vedrai la presenza di aspecifici.... A me è successo

Magnifico atque victoriosissimo Domino, Domino Kani Grandi de la Scala.
Torna all'inizio della Pagina

cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
Città: Padova


558 Messaggi

Inserito il - 03 maggio 2006 : 12:18:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ma intendi dire di seminare i punti della curva standard?
Di solito se non ci sono problemi tipo H2O positive o campioni con Melting strana non lo facciamo, tanto meno se ho tutto OK con un'efficienza alta.
Comunque ci è venuto in mente che il problema potrebbe essere legato ad un altro fattore, sto facendo delle prove, vi saprò dire.....
Torna all'inizio della Pagina

cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
Città: Padova


558 Messaggi

Inserito il - 10 maggio 2006 : 16:01:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Le prove consistevano nel diluire ulteriormente i primers,li ho diluiti 1:3, poi ho ripetuto diluendo ulterirmente di 1:3, ma non è cambiato un fico secco; bè stanno riscrivendo i primers.....
Torna all'inizio della Pagina

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 10 maggio 2006 : 17:09:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh allora è plausibile che il problema sia che i primers non siano specifici e ti amplifichino qualche cos'altro... non hai poi provato a seminare su gel come suggeriva Cangrande???

Comunque se è così con dei nuovi primers dovresti risolvere il problema!

In bocca al lupo!
Torna all'inizio della Pagina

calimero
Nuovo Arrivato


Prov.: Verona
Città: verona


2 Messaggi

Inserito il - 12 maggio 2006 : 14:34:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di calimero Invia a calimero un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao,
l'effiecienza di una reazione si misura a partire dall'amplificazione degli standard e da essa dipende la retta di taratura che ottieni: per esempio se fai diluizioni seriali decimali la distanza tra cicli soglia consecutivi deve essere 3,3 (numero che si ricava dall'equazione matematica che descrive la quantificazione in la real-time, la trovi facilmente in letteratura). Se per motivi legati alla cinetica della reazione (scelta primer, magnesio, forza ionica etc) il valore di 3,3 non viene rispettato l'efficienza varia: in particolare se la distanza tra i cicli soglia consecutivi dei tuoi standard è inf. a 3,3 l'eff. sarà sup al 100%; al contrario avrai eff. inf al 100% per distanze superiori a 3,3. I motivi di ciò sono squisitamente matematici, anche se riflettono diverse dinamiche di reazione, che al contrario vanno come vogliono loro!
L'efficienza determina la pendenza della retta di taratura, e questa la quantificazione dei tuoi campioni. Cerca quindi di stare sempre vicino a 100 per essere sicura di quant. bene
Controlla i tuoi amplificati ed escludi la presenza di prodotti aspecifici, acquisisci il segnale 2-3 gradi sotto la melting del tuo frammento, fatto ciò vai tranquilla!
buon lavoro
Torna all'inizio della Pagina

cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
Città: Padova


558 Messaggi

Inserito il - 16 maggio 2006 : 15:20:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie
Torna all'inizio della Pagina

cristiano
Nuovo Arrivato


Prov.: Novara
Città: novara


37 Messaggi

Inserito il - 17 maggio 2006 : 15:54:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cristiano Invia a cristiano un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Bene, io ho una distanza tra cicli soglia consecutivi, nelle diluizioni seriali decimali, inferiore a 1, quando va bene, se no è 0 o addirittura il Ct è inferiore più il campione è diluito. Ho caricato su gel e non ci sono aspecifici, a parte il bandone di dimeri di primer che mi porto sempre dietro. In compenso il controllo negativo, o bianco, a un Ct a circa 17 cicli. Che faccio?

CRI
Torna all'inizio della Pagina

cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
Città: Padova


558 Messaggi

Inserito il - 18 maggio 2006 : 09:53:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Quante paia di basi sono i tuoi primers?
Torna all'inizio della Pagina

cristiano
Nuovo Arrivato


Prov.: Novara
Città: novara


37 Messaggi

Inserito il - 19 maggio 2006 : 09:14:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cristiano Invia a cristiano un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
21 il forward 25 il reverse

CRI
Torna all'inizio della Pagina

cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
Città: Padova


558 Messaggi

Inserito il - 22 maggio 2006 : 13:09:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scusa, ho sbagliato la domanda:volevo dire quante paia di basi è il tuo amplificato?
Se ho capito bene al posto di avere all'incirca 3 cicli tra uno standard ed un altro diluito dieci volte di più rispetto al primo,hai solo un ciclo?
Ed in sostanza il controllo negativo ti viene positivo? Cosa metti H2O o solo mix?
Bè se è così,la prima cosa che mi verrebbe da fare nel tuo caso sarebbe quella di diluire ulteriormente i primers.
Torna all'inizio della Pagina

cristiano
Nuovo Arrivato


Prov.: Novara
Città: novara


37 Messaggi

Inserito il - 23 maggio 2006 : 11:49:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cristiano Invia a cristiano un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
l'amplificato è di 339bp e i primer sono già abbastanza diluiti credo, lavoriamo con conc 0,15 uM. Il problema del controllo negativo (H2O + mix) è probabilmente dovuto a contaminazioni (spero), la prox volta provo a usare i puntali col filtro e vediamo.
Il dubbio che mi è sorto è questo: io parto da una concentrazione ignota di DNA e preparo una diluizione 1:10 e una 1:100 e dovrei trovare una differenza di cicli soglia tra una diluizione e l'altra di 3.3. Ma se il mio DNA di partenza è molto molto concentrato, mi bastano 2 diluizioni per vedere questa differenza? ci sarà un limite al di sopra del quale questa regola non vale più, altrimenti, in via teorica, a concentrazioni elevatissime corrisponderebbero Ct di 3-4, che mi sembra un po' poco.
Aggiungo in ogni caso che non ho mai seguito corsi di real time (ma lo faro' al più presto prometto!) per cui la mia ignoranza in materia è del tutto giustificata.

CRI
Torna all'inizio della Pagina

cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
Città: Padova


558 Messaggi

Inserito il - 23 maggio 2006 : 14:28:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io lavoro con il c-DNA, ma penso sia lo stesso; in effetti, nel costruirmi la curva, mi è successo di partire da uno standard troppo concentrato ed in effetti quando tra il primo ed il secondo punto di standard non c'era il giusto numero di cicli e nelle successive diluizioni invece sì, lasciavo perdere le prime diluizioni e mi spingevo verso il basso.
Normalmente facciamo una prova primers dove valutiamo la diversa concentrazione dei primers; successivamente una "prova di efficienza" dove mi costruisco una curva a diluizioni scalari 1:10 oppure 1:5 a seconda dei casi ( se esce presto, tipo attorno ai 20 cicli opto per l'1:10, se verso i 30 cicli invece uso l'1:5) e faccio da 5 anche a 7 diluizioni consecutive.
Il problema degli standard è che ne devi usare uno molto espresso per i tuoi campioni, affinchè stiano nella curva.
Noi lavoriamo solo con puntali con il filtro e dopo aver perso un tempo immane a causa delle contaminazioni abbiamo separato fisicamente ( tramite due stanze distine) la zona pre da quella post-PCR ed abbiamo risolto tutti i problemi.
Noi usiamo il syber green.
Il tuo amplificato è un pò grande per la real,da quel che mi risulta sarebbe bene non superare le 200 bp, non so se ciò è legato al syber.
In effetti noi lavoriamo ad una concentrazione di primers di 1.2uM iniziale (prima di metterli nella mix di reazione)che equivalgono a 0.3uM finale nella mix.
Be', anch'io non ho mai fatto un corso, e si vede....vorrei fare quello della Biorad, ma oltre ad essere costoso dura 4 giorni e questo mi causa dei problemi, comunque da quel che mi pare di capire nel mio approccio alla real è che impari moltissimo sul campo e che l'esperienza o i consigli di chi ti sta vicino ti danno molto più di un qualsiasi corso.
Torna all'inizio della Pagina

barbapapà
Nuovo Arrivato



10 Messaggi

Inserito il - 19 febbraio 2007 : 15:41:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di barbapapà Invia a barbapapà un Messaggio Privato  Rispondi Quotando

A distanza di quasi un anno, posso chiedere a cin come ha risolto il suo problema? e cristiano?

Grazie
ciao
barbapapà
Torna all'inizio della Pagina

283
Nuovo Arrivato



115 Messaggi

Inserito il - 30 luglio 2012 : 23:11:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 283 Invia a 283 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
se fai diluizioni seriali decimali la distanza tra cicli soglia consecutivi deve essere 3,3 (numero che si ricava dall'equazione matematica che descrive la quantificazione in la real-time, la trovi facilmente in letteratura).

ciao!
anche se sn passati molti anni ho trovto la tua risposta molto utile (grazie)..ma non sn riuscita a trovare nulla al proposito in letteratura..sapresti dirmi dove l'hai trovato?

grazie per la tua disponibilità
Torna all'inizio della Pagina

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 31 luglio 2012 : 00:24:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Per favore se citi la risposta di qualcuno utilizza il tag "quote" o quantomeno utilizza le virgolette!

Citazione:
Messaggio inserito da 283

..ma non sn riuscita a trovare nulla al proposito in letteratura..sapresti dirmi dove l'hai trovato?


Su un qualunque manuale di real-time lo trovi! Il numero esatto è 3,322 è la stessa identica cosa che spiegavo qui: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=26367#126687
e non è altro che, come detto anche da calimero, una pura questione matematica.
2^n = 10
Torna all'inizio della Pagina

283
Nuovo Arrivato



115 Messaggi

Inserito il - 31 luglio 2012 : 08:07:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 283 Invia a 283 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
la citazione è un problema che cn il mio pc ma farò in modo di fare nel modo corretto..

si so che si trova nei manuali etc ma ciò che mi serviva capire è come varia questa distanza dei cicli cambinado tipo di diluizione..ovvero con diluizioni di un fattore di 5 per es.

cmq grazie mille
Torna all'inizio della Pagina

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 31 luglio 2012 : 08:22:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
la citazione è un problema che cn il mio pc ma farò in modo di fare nel modo corretto..


Basta usare il tag quote. Una spiegazione completa dei tags la trovi qui

Citazione:
ciò che mi serviva capire è come varia questa distanza dei cicli cambinado tipo di diluizione..ovvero con diluizioni di un fattore di 5 per es.


2^n = fattore di diluizione

Per un fattore 5

2^n=5 n~=2.3219

Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui

My photo portfolio (now on G+!)
Torna all'inizio della Pagina

283
Nuovo Arrivato



115 Messaggi

Inserito il - 01 agosto 2012 : 11:10:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 283 Invia a 283 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando


Citazione:


2^n = fattore di diluizione

Per un fattore 5

2^n=5 n~=2.3219



grazie mille per la risposta. pongo un'altra domanda: si potresti dire come si fa di solito una prova per valutare la concentrazione dei primers?
Torna all'inizio della Pagina

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 02 agosto 2012 : 08:38:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
si potresti dire come si fa di solito una prova per valutare la concentrazione dei primers?


Non l'ho mai fatto in vita mia, ma direi che semplicemente fai delle diluizioni dei tuoi primers e vedi quella più bassa che funziona...

Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui

My photo portfolio (now on G+!)
Torna all'inizio della Pagina
  Discussione  

Quanto è utile/interessante questa discussione:

 Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
Vai a:
MolecularLab.it © 2003-18 MolecularLab.it Torna all'inizio della Pagina