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Flap
Utente Junior

172 Messaggi

Inserito il - 13 luglio 2009 : 15:50:34

Ciao ragazzi...ho bisogno di un consiglio. Ho espresso una proteina virale ( L1 dell'HPV ) in Bl21..fatto le prove di induzione e visto che la proteina si trova nel sovranatante parzialmente degradata. Decido di purificarla attraverso le colonnine ( Nin ta spin coluns ). Faccio il subinoculo in 50 ml addizionato con l'antibiotico amp a cui le cellule trasformate con il mio plasmide sono resistenti. Il lisato lo faccio per sonicazione..allo stesso modo di come l'avevo fatto per la prima volta con i miei 10 ml delle prove di induzione. Per ben 3 volte non solo non riesco a purificare la proteina ma non me la ritrovo pi� neanche nel lisato. Ma ho utlizzato le stesse condizioni della prova in 10 ml!!!Perch� in 10 si e in 50 no? Al di la della purificazione la proteina non c'� pi� neanche nel lisato. Qualsiasi consiglio � ben accetto..e se non mi sono spiegata bene chiedetemi. Grazie.

l�
Utente Junior

565 Messaggi

Inserito il - 14 luglio 2009 : 11:52:40

se non c'� nel lisato allora non si sar� espressa. usi l'IPTG? quanto?

l�
Utente Junior

565 Messaggi

Inserito il - 14 luglio 2009 : 11:54:05

e che plasmide usi?

Iside
Utente Attivo

Citt�: Napoli

1375 Messaggi

Inserito il - 14 luglio 2009 : 12:06:03

visto che nelle prove di induzione hai visto che la proteina si � degradata, dovresti provare a caricare il pellet che ottieni dalla centrifugazione dopo aver sonicato, pu� darsi che la proteina sia precipitata e sia rimasta l�. altra cosa, hai aggiunto sempre gli inibitori delle proteasi? io li riaggiungo ogni 2 ore...

...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...

l�
Utente Junior

565 Messaggi

Inserito il - 14 luglio 2009 : 12:32:09

s�, potrebbe essere nei corpi inclusi

Flap
Utente Junior

172 Messaggi

Inserito il - 28 luglio 2009 : 10:49:21

Scusate il ritardo ragazzi..sono stata in ferie aniticipate ma adesso ritento l'esperimento e incrocio le dita. Adesso ripsondo alle vostre domande:
- plasmide pET 101
- IPTG 0.2mM perch� dalle prove di induzione risultava esprimere la proteina meglio dell'1M.
- Le prove di induzione le ho fatte in 10 ml...dopo aver sonicato il lisato ho caricato pellet e sovranatante e fatto un immunoblot e la proteina si trova solo nel sovranatante e come ho gia detto parzialmente degradata.
- Ho aggiunto l'inibitore delle proteasi prima della prima sonicazione..il lisato lo faccio in mezzora quindi se dici che li aggiungo ogni 2 ore..nel mio caso non ha senso perch� dopo aver sonicato centrifugo e carico in gel di poliacrillamide.
Il mio problema � che le in 10 ml dimostravano che la proteina veniva indotta..quando invece ho provato in 50 non c'era pi� nessuna traccia di lei. Potrebbe esserci una certa variabilit� tra le colonie di una piastra cresciute in terreno selettivo? Nel senso che alcune esprimono la proteina ed altre no? Adesso prover� a prenderne 5 e ad indurre separatamente..faccio 5 lisati e carico in pozzetti differenti nel gel. Se in alcuni c'� la proteina e in altri no..forse non tutte le colonie riescono ad esprimere la proteina per qualchje ragione che proprio non conosco...

Flap
Utente Junior

172 Messaggi

Inserito il - 29 luglio 2009 : 16:13:07

Mi � venuta in mente una possibile ipotesi..mi date qualche parere?Io sto usando il pET 101 cone resistenza ad ampicillina.La resistenza � data dunque dalle betalattamasi che vengono secrete nel mezzo..Io faccio il subinoculo da un inoculo con amp cresciuto O.N...in teoria la presenza dell'antibiotico dovrebbe assicurarmi che in quell'inoculo le cellule con il plasmide vengano mantenute..ma in pratica le betalattamsi vengono secret nel mezzo e dopo una notte di incubazione l'ampicillina che ci stava � stata distrutta credo.quindi gia nel mio inoculo io ho cellule che hanno il plasmide e cellule che non ce l'hanno perch� l'hanno perso nella fase di saturazione. Poi faccio il subinoculo utilizzando quello stesso mezzo che contiene betalattamasi e nel subinoculo metto l'ampicillina che induce altre betalattamsi. anche in questo caso le cellule che non hanno il plasmide sopravvivono. Poi se considero che la proteina indotta � tossica perch� � una proteina virale la situazione si complica ancora perch� le cellule che hanno il plasmide sarano ancora pi� svantaggiate e per la legge della sopravivenza muoiono. � possibile tutto questo? Scusate..sto un po sragionando:)

Iside
Utente Attivo

Citt�: Napoli

1375 Messaggi

Inserito il - 29 luglio 2009 : 16:26:26

Citazione:
Messaggio inserito da Flap

� possibile tutto questo? Scusate..sto un po sragionando:)

...

non penso che sia possibile tutto questo. in questo caso nessuno riuscirebbe pi� a purificare proteine da vettori con AmpR!!!

ti ripeto, secondo me perdi la proteina nei vari step di purifcazione...

...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...

l�
Utente Junior

565 Messaggi

Inserito il - 29 luglio 2009 : 16:41:49

ciao! anche io sono d'accordo con iside. tu quindi la perdi perdi tutto dopo la prima colonna giusto? come tag usi l'istidina immagino.
che tamponi usi per eluire la proteina?

Iside
Utente Attivo

Citt�: Napoli

1375 Messaggi

Inserito il - 29 luglio 2009 : 16:45:01

giusto, e se la proteina non venisse eluita? aggiungi anche l� gli inbitori? ti basta uno sbalzo di pH nel tampone che ti parte tutta la purificazione!

...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...

Iside
Utente Attivo

Citt�: Napoli

1375 Messaggi

Inserito il - 29 luglio 2009 : 16:46:03

ah dimenticavo, hai provato a correre anche un po' di resina?

...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...

Flap
Utente Junior

172 Messaggi

Inserito il - 30 luglio 2009 : 16:24:20

Il mio problema non � nella purificazione..la proteina non sta pi� nenache nel lisato mentre dalle prove di induzione riusltava che la proteina veniva espressa. Nel senso che passando dalla piccola scala alla grande scala ( da 10 in 50 ) non c'� pi� abbastanza proteina indotta da essere rilevata per western blot. � per questo che mi � venuto in mente quest'ipotesi..leggendo il manuale del pET 101 dice per usare il plasmide con resistenza all'ampicillina bisogna utilizzare degli accorgimentio che mirino a rendere il plasmide pi� stabile..come non far arrivare le cellule a saturazione o subinoculare utilizzando solo il pellet dopo aver fatto almeno un lavaggio. Certo..questi accorgimenti non li ho utilizzati nelle prove di induzione ( perch� non avevo fatto caso a questa nota del manuale) e la proteina veniva indotta igulamente ma magari ho pensato che diventando il lisato pi� concentrato ed essendo la mia proteina tossica le cellule con il plasmide sono ulteriormente svantaggiate. Non so se mi sono spiegata bene..comunque la purificazione per il momento non m'interessa perch� se non ho la proteina nel lisato � normale che non ce l'abbia nell'eluito.

Flap
Utente Junior

172 Messaggi

Inserito il - 13 agosto 2009 : 17:36:01

Ho risolto il mio problema..non � che la proteine non si esprime a 50..� solo che non tutti i cloni di una stessa placca la esprimono, non so perche. Ma ho fatto delle prove di induzione su 5 cloni e solo 2 di questi la esprimono. Quindi risolvo facendo ddegli spicchi..grazie a tutti per i consigli.

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