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annie_p
Nuovo Arrivato



2 Messaggi

Inserito il - 27 luglio 2009 : 19:29:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di annie_p Invia a annie_p un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti, avrei bisogno di un aiutino per un clonaggio...
Dunque l'inserto di interesse sta gia' all'interno di un vettore e so che posso ottenerlo digerendo il vettore con ecor1 e xho1.
Il problema e' che una volta ottenuto l'inserto voglio inserirlo in un altro vettore e so che i siti unici di restrizione in questo vettore sono xho1,ecor5,ecor1,sma1.Quello che ho subito pensato e' stato:taglio l'inserto con ecor1 e xho1 faccio lo stesso col vettore MA la posizione in cui i siti di restrizione sono nel vettore di interesse porterebbe si ad avere l'inserto ma orientato in modo antisenso...che cosa fare?
Spero che qualcuno mi possa aiutare,GRAZIE!

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 27 luglio 2009 : 20:48:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh di soluzioni ce ne sono varie, a parte cercare altri enzimi compatibili, ad es.
- poi anziché excidere il frammento dal primo plasmide, amplificarlo mediante PCR utilizzando primers che contengano i siti di restrizione giusti
- attaccare degli adapter che modifichino i tuoi siti di restrizione in modo da renderli compatibili con quelli del secondo vettore
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annie_p
Nuovo Arrivato



2 Messaggi

Inserito il - 27 luglio 2009 : 21:14:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di annie_p Invia a annie_p un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao GFPina,grazie della risposta veloce...
Nn capisco che cosa intendi quando dici cercare degli altri enzimi compatibili (t puoi spiegare meglio perfavore?), inoltre che differenza c'e' tra la seconda e la terza opzione che m proponi?
Grazie d nuovo!
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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 27 luglio 2009 : 21:20:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
La più rapida soluzione che mi viene in mente è quella
di scegliere un terzo sito nel tuo plasmide di destinazione
che si trovi in una posizione più "a valle" rispetto al tuo
enzima 5'(non so qual'è dei due che hai nominato) poi bluntare
il vettore linearizzato con la Klenow e ri-digerire il frammento,
utilizzando -stavolta - il to enzima 5'. In giornata puoi farcela.

In questo modo dovresti riuscire a clonare direzionalmente il tuo
frammento, a patto che sottoponga allo stesso trattamento il costrutto
d'origine, facendo due digestioni successive (PRIMA con l'enzima che
taglia al 3' e POI con l'enzima che taglia al 5', in ordine).

Non so quale sia la probabilità di successo, ma io comunque
tenterei questa cosa e , al limite, se vedi che non funge,
allora ti conviene ordinare nuovi primers (as GFPina told u)....


Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!


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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 27 luglio 2009 : 21:32:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Tipo metti che il tuo costrutto d'origine è :

-----5'-EcoRI-INSERTO-XhoI-3'-------

e il tuo vettore di destinazione è

-----5'-XhoI-EcoRI-*XbaI*-3'-----

Poni il caso di avere, come ti ho indicato per fare
un esempio, un sito *XbaI* che si trova più a valle
di EcoRI , all'interno dello stesso sito di clonaggio

Procedi in questo ordine:
1) Tagli il costrutto d'origine con XhoI
2) Tagli il vettore di destinazione con XbaI
3) Ora li rendi entrambi blunt con la Klenow
4) Tagli il costrutto d'origine (bluntato) con EcoRI
-----> purifichi da gel il frammento più piccolo
--------> ottieni un inserto 5'sticky-3'blunt

5) Tagli il vettore di destinazione (bluntato) con EcoRI
-----> purifichi da gel il frammento più grande
--------> ottieni un vettore sticky-blunt compatibile

6) Defosforili il vettore e ci lighi assieme l'inserto ottenuto

Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

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