Autore |
Discussione |
|
miky76
Utente Junior
![](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_star_gold.gif)
126 Messaggi |
Inserito il - 04 agosto 2009 : 17:04:23
|
ciao
sto facendo un clonaggio con una estremita' blunt e l'atra e' coesiva secondo il protocollo che mi hanno dato devo rendere blunt l'estremita' coesiva
ora la mia domanda e' ma perche' devo avere entrambe le estremita' blunt? non posso clonare cosi come ho le estremita'?
inoltre di solito se si hanno estremita' blunt si defosforila il vettore (almeno io faccio cosi) qualcuno di voi ha mai provato a clonare senza defosforilare il vettore? quest'ultima domanda e' una mia pura curiosita'
grazie mille
![](/forum/faccine/ciao.gif)
|
|
|
Dionysos
Moderatore
![](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_star_cyan.gif) ![](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_star_cyan.gif) ![](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_star_cyan.gif)
![D](/Public/avatar/dionysos/200732013132_D.jpg)
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 04 agosto 2009 : 19:51:47
|
Citazione: ora la mia domanda e' ma perche' devo avere entrambe le estremita' blunt? non posso clonare cosi come ho le estremita'?
E' difficile risponderti con esattezza senza avere un'idea più precisa della situazione: sarebbe meglio avere una mappa del vettore di clonaggio e magari anche del frammento che vuoi clonare, per capire meglio.
Verrebbe istintivo risponderti che probabilmente ti hanno detto di fare così perchè l'estremità coesiva del frammento non è compatibile con alcuno dei siti presenti nel vettore. Pare strano, in effetti, anche perchè la scelta di fare un clonaggio blunt è di solito l'ultima spiaggia, viste le complicazioni che comporta.
Citazione: inoltre di solito se si hanno estremita' blunt si defosforila il vettore (almeno io faccio cosi) qualcuno di voi ha mai provato a clonare senza defosforilare il vettore? quest'ultima domanda e' una mia pura curiosita'
Prima o poi capiterà anche a te di dimenticarti di defosforilare :P ti accorgerai che si riduce l'efficienza di clonaggio, cioè il seguente rapporto tenderà ad avvicinarsi a zero:
colonie INS - n. colonie BB / n. colonie INS
Dove INS indica le colonie ricombinanti (ligazione vettore + inserto) mentre BB quelle non ricombinanti (ligazione del solo vettore, cioè la quota di ricircolarizzazione dello stesso).
Il motivo è semplice: un acido nucleico con il 5' fosforilato è un substrato ottimale per la reazione di ligazione, mentre un 5' defosforilato non lo è (o non dovrebbe!)
|
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà (F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
|
![Torna all'inizio della Pagina Torna all'inizio della Pagina](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_go_up.gif) |
|
miky76
Utente Junior
![](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_star_gold.gif)
126 Messaggi |
Inserito il - 05 agosto 2009 : 13:52:51
|
ciao
grazie per la risposta
si io non amo il clonaggio blunt mai che mi si inserisce l'inserto nel giusto verso! sempre al contrario
putroppo non mi lasciano accedere alla mappa del plasmide che sto usando e' un plasmide casereccio e sembra che si siano persi la mappa!
ma sto usando una strategia che hanno gia fatto nel mio lab ma non sanno perche'!
alla mia donada perche' devo rendere blunt l'altra estremita' mi hanno risposto che un clonaggio con estremita' blunt e coesivo NON funziona
gli enzimi sono ecorI e ScaI
ScaI e' blunt
mi sembra strano che il vettore non abbia EcorI
e mi chiedevo perche' non dovrebbe funzionare se lascio una estremita' coesiva e una blunt
mai fatto un clonaggio cosi ma in teoria dovrebbe funzionare e anzi dovrebbe garantirmi che l'inserto si inserisce bene
![](/forum/faccine/ciao.gif) |
![Torna all'inizio della Pagina Torna all'inizio della Pagina](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_go_up.gif) |
|
Dionysos
Moderatore
![](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_star_cyan.gif) ![](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_star_cyan.gif) ![](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_star_cyan.gif)
![D](/Public/avatar/dionysos/200732013132_D.jpg)
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 05 agosto 2009 : 15:20:58
|
Citazione: alla mia donada perche' devo rendere blunt l'altra estremita' mi hanno risposto che un clonaggio con estremita' blunt e coesivo NON funziona
I miei batteri la pensano diversamente :P
A parte gli scherzi, probabilmente intendono dire che un inserto sticky-blunt si inserisce con bassissima efficienza in un vettore tagliato sticky e linearizzato, certo, ma se tu invece ti preoccupi di rendere ANCHE il vettore sticky-blunt allo stesso modo e secondo l'orientamento concorde all'inserto, il clonaggio funziona eccome. A testimonianza io ho subclonato un frammentino di 200 bp in quel modo (e il vettore aveva quasi 10 kb di stazza, quindi figurati...).
Il mio supervisor di lab mi dice sempre che avere una strategia di clonaggio 'direzionale' è la cosa più importante! |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà (F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
|
![Torna all'inizio della Pagina Torna all'inizio della Pagina](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_go_up.gif) |
|
Dionysos
Moderatore
![](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_star_cyan.gif) ![](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_star_cyan.gif) ![](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_star_cyan.gif)
![D](/Public/avatar/dionysos/200732013132_D.jpg)
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 05 agosto 2009 : 15:26:53
|
Citazione: gli enzimi sono ecorI e ScaI
ScaI e' blunt
mi sembra strano che il vettore non abbia EcorI
e mi chiedevo perche' non dovrebbe funzionare se lascio una estremita' coesiva e una blunt
Per quanto riguarda EcoRI basterebbe una digestione di prova per vedere se c'è o no. Il problema è semmai capire dove si trova rispetto al sito ScaI (che, se ho capito bene, è il sito in cui vorrebbero tu clonassi)
Potrebbe darsi che se tu tagli il vettore con EcoRI e ScaI, e poi c'inserisci il tuo frammento, questo s'inserisce, sì, ma in una posizione o in un verso che non è quello desiderato! Non potrebbe essere così?
|
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà (F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
|
![Torna all'inizio della Pagina Torna all'inizio della Pagina](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_go_up.gif) |
|
GFPina
Moderatore
![](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_star_cyan.gif) ![](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_star_cyan.gif) ![](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_star_cyan.gif) ![](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_star_cyan.gif) ![](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_star_cyan.gif)
![GFPina](/Public/avatar/GFPina/2008510154452_monella_2.gif)
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 agosto 2009 : 18:16:00
|
Beh concordo con Dionysos, certo tutta sta storia è strana. In teoria è un controsenso favorire un clonaggio blunt rispetto a uno sticky-blunt, certo che senza mappa del vettore puoi fare poco! A meno di non metterti a farla e scoprire se e dove taglia EcoRI! ![](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_smile_tongue.gif) (ovviamente scherzo sarebbe una bella perdita di tempo!)
Però scusa dopo aver inserito l'inserto come lo sequenzi? Hai dei primers disegnati sul vettore? Altrimenti potresti pensare di sequenziare il pezzo di vettore e vedere che siti di restrizione ci sono... certo che avere un vettore senza mappa... mi sembra veramente assurdo... |
![Torna all'inizio della Pagina Torna all'inizio della Pagina](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_go_up.gif) |
|
miky76
Utente Junior
![](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_star_gold.gif)
126 Messaggi |
Inserito il - 06 agosto 2009 : 15:39:18
|
ciao
grazie per le risposte
almeno so che il clonaggio stick/blunt funziona e certo che bisogna rendere anche il vettore stick/blunt
![](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_smile_big.gif)
mah.... il problema e' questo lab ha un capo che sta la perche' amico di... non sa nulla di biologia molecolare e chi ha fatto lquesta strategia di clonaggio ha lasciato questo lab
quindi non so se era una persona competente o no
io seguo la strategia che mi hanno detto anche perche' senza mappa non posso fare altrimenti
e non mi va di mettermi a fare prove per vedere se la mappa ha ecoRI anche perche' non saprei dove e' e che comporta tagliare in quel punto
mah almeno so che i miei dubbi erano sensati e che come io proponevo la strategia stick/blunt funziona
e per trovare le colonie positive faro' una doppia digestione enzimatica con un enzima dentro il mio inserto e uno nel vettore secondo la grandezza del taglio dovrei sapere se l'inserto e' inserito nel verso giusto
poi comunque lo testo in cellule
ancora grazie
e si concordo fare un clonaggio senza mappa e' assurdo ma di assurdita' in questo lab ne succedono
![](/forum/faccine/ciao.gif) |
![Torna all'inizio della Pagina Torna all'inizio della Pagina](https://www.molecularlab.it/forum/immagini/icon_go_up.gif) |
|
|
Discussione |
|