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 curiosita' su un clonaggio
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miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 04 agosto 2009 : 17:04:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao

sto facendo un clonaggio con una estremita' blunt e l'atra e' coesiva
secondo il protocollo che mi hanno dato devo rendere blunt l'estremita' coesiva

ora la mia domanda e'
ma perche' devo avere entrambe le estremita' blunt?
non posso clonare cosi come ho le estremita'?

inoltre di solito se si hanno estremita' blunt si defosforila il vettore (almeno io faccio cosi)
qualcuno di voi ha mai provato a clonare senza defosforilare il vettore?
quest'ultima domanda e' una mia pura curiosita'

grazie mille




Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 04 agosto 2009 : 19:51:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
ora la mia domanda e'
ma perche' devo avere entrambe le estremita' blunt?
non posso clonare cosi come ho le estremita'?

E' difficile risponderti con esattezza senza avere
un'idea più precisa della situazione: sarebbe meglio
avere una mappa del vettore di clonaggio e magari anche
del frammento che vuoi clonare, per capire meglio.

Verrebbe istintivo risponderti che probabilmente ti
hanno detto di fare così perchè l'estremità coesiva
del frammento non è compatibile con alcuno dei siti
presenti nel vettore. Pare strano, in effetti, anche
perchè la scelta di fare un clonaggio blunt è di solito
l'ultima spiaggia, viste le complicazioni che comporta.

Citazione:
inoltre di solito se si hanno estremita' blunt
si defosforila il vettore (almeno io faccio cosi) qualcuno
di voi ha mai provato a clonare senza defosforilare il vettore?
quest'ultima domanda e' una mia pura curiosita'


Prima o poi capiterà anche a te di dimenticarti di defosforilare :P
ti accorgerai che si riduce l'efficienza di clonaggio, cioè il
seguente rapporto tenderà ad avvicinarsi a zero:

colonie INS - n. colonie BB / n. colonie INS

Dove INS indica le colonie ricombinanti (ligazione vettore
+ inserto) mentre BB quelle non ricombinanti (ligazione del
solo vettore, cioè la quota di ricircolarizzazione dello stesso).

Il motivo è semplice: un acido nucleico con il 5' fosforilato
è un substrato ottimale per la reazione di ligazione, mentre
un 5' defosforilato non lo è (o non dovrebbe!)




Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!


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miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 05 agosto 2009 : 13:52:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao

grazie per la risposta

si io non amo il clonaggio blunt
mai che mi si inserisce l'inserto nel giusto verso!
sempre al contrario

putroppo non mi lasciano accedere alla mappa del plasmide che sto usando
e' un plasmide casereccio e sembra che si siano persi la mappa!

ma sto usando una strategia che hanno gia fatto nel mio lab
ma non sanno perche'!

alla mia donada perche' devo rendere blunt l'altra estremita'
mi hanno risposto che un clonaggio con estremita' blunt e coesivo NON funziona

gli enzimi sono ecorI e ScaI

ScaI e' blunt

mi sembra strano che il vettore non abbia EcorI

e mi chiedevo perche' non dovrebbe funzionare se lascio una estremita' coesiva e una blunt

mai fatto un clonaggio cosi ma in teoria dovrebbe funzionare
e anzi dovrebbe garantirmi che l'inserto si inserisce bene

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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 05 agosto 2009 : 15:20:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
alla mia donada perche' devo rendere blunt l'altra estremita'
mi hanno risposto che un clonaggio con estremita' blunt e coesivo NON funziona


I miei batteri la pensano diversamente :P

A parte gli scherzi, probabilmente intendono dire che
un inserto sticky-blunt si inserisce con bassissima
efficienza in un vettore tagliato sticky e linearizzato,
certo, ma se tu invece ti preoccupi di rendere ANCHE il vettore
sticky-blunt allo stesso modo e secondo l'orientamento concorde
all'inserto, il clonaggio funziona eccome. A testimonianza io
ho subclonato un frammentino di 200 bp in quel modo (e il vettore
aveva quasi 10 kb di stazza, quindi figurati...).

Il mio supervisor di lab mi dice sempre che avere una
strategia di clonaggio 'direzionale' è la cosa più importante!

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(F.W. Nietzsche)

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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 05 agosto 2009 : 15:26:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
gli enzimi sono ecorI e ScaI

ScaI e' blunt

mi sembra strano che il vettore non abbia EcorI

e mi chiedevo perche' non dovrebbe funzionare se lascio una estremita' coesiva e una blunt



Per quanto riguarda EcoRI basterebbe una digestione
di prova per vedere se c'è o no. Il problema è semmai
capire dove si trova rispetto al sito ScaI (che, se ho
capito bene, è il sito in cui vorrebbero tu clonassi)

Potrebbe darsi che se tu tagli il vettore con EcoRI
e ScaI, e poi c'inserisci il tuo frammento, questo
s'inserisce, sì, ma in una posizione o in un verso
che non è quello desiderato! Non potrebbe essere così?

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 05 agosto 2009 : 18:16:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh concordo con Dionysos, certo tutta sta storia è strana.
In teoria è un controsenso favorire un clonaggio blunt rispetto a uno sticky-blunt, certo che senza mappa del vettore puoi fare poco!
A meno di non metterti a farla e scoprire se e dove taglia EcoRI!
(ovviamente scherzo sarebbe una bella perdita di tempo!)

Però scusa dopo aver inserito l'inserto come lo sequenzi? Hai dei primers disegnati sul vettore? Altrimenti potresti pensare di sequenziare il pezzo di vettore e vedere che siti di restrizione ci sono... certo che avere un vettore senza mappa... mi sembra veramente assurdo...
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miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 06 agosto 2009 : 15:39:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao

grazie per le risposte

almeno so che il clonaggio stick/blunt funziona
e certo che bisogna rendere anche il vettore stick/blunt


mah.... il problema e' questo lab ha un capo che sta la perche' amico di...
non sa nulla di biologia molecolare
e chi ha fatto lquesta strategia di clonaggio ha lasciato questo lab

quindi non so se era una persona competente o no

io seguo la strategia che mi hanno detto
anche perche' senza mappa
non posso fare altrimenti

e non mi va di mettermi a fare prove per vedere se la mappa ha ecoRI
anche perche' non saprei dove e' e che comporta tagliare in quel punto

mah
almeno so che i miei dubbi erano sensati e che come io proponevo
la strategia stick/blunt funziona

e per trovare le colonie positive faro' una doppia digestione enzimatica con un enzima dentro il mio inserto e uno nel vettore
secondo la grandezza del taglio dovrei sapere se l'inserto e' inserito nel verso giusto

poi comunque lo testo in cellule

ancora grazie

e si concordo fare un clonaggio senza mappa e' assurdo
ma di assurdita' in questo lab ne succedono

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