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vesania
Nuovo Arrivato

Citt�: rovigo-ferrara-rovigo

98 Messaggi

Inserito il - 13 agosto 2009 : 11:09:43

sbirciando nella sezione protocolli ho trovato questo protocollo di precipitazione dei prodotti di pcr http://www.molecularlab.it/protocolli/protocol.asp?id=23
Questo protocollo potrebbe favorire una resa maggiore, ossia una visualizzazione piu' nitida durante il controllo della digestione con corsa elettroforetica?

gilthanas
Nuovo Arrivato

100 Messaggi

Inserito il - 19 agosto 2009 : 23:42:47

direi proprio di no...non mi sembra una grande idea...

tanto per carire meglio...

il frammento di PCR che ottieni � molto abbondante???
in quanto fai la reazione di PCR 50, 25 o 15 ul??

io ti dico...ne ho fatto un be p� di quel tipo di RFLP...

in genere usavo 10ul di PCR (non purificata, non � cos� necessario)
facevo la digestione in un volume finale di 20ul
buffer e BSA se necesario
e un bel p� di enzima...tipo 5-10 unit�..poi digestione 3h a 37�C

dovresti andare sul sicuro...

allora: quante volte taglia il tuo enzima nel frammento di PCR?

pi� volte taglia e meno abbondanti saranno i frammenti che otterrai...soprattutti quelli pi� piccoli...

la cosa milgiore da fare � partire con pi� materiale da digerire e aumentare l'apporto di enzima di conseguenza... (per es. fare la PCR in 50ul ed usarne 20 per la digestione portando il volume finale a 30-40ul al max)..

tutto qui...

vesania
Nuovo Arrivato

Citt�: rovigo-ferrara-rovigo

98 Messaggi

Inserito il - 20 agosto 2009 : 11:25:52

Infatti gi� faccio cos�, la pcr � effettuata in un volume finale di 50 ul, e la digestione � condotta con 25 ul di prodotto di pcr e 5 ul di mx di digestione. l'enzima taglia solo una volta

gilthanas
Nuovo Arrivato

100 Messaggi

Inserito il - 25 agosto 2009 : 00:56:41

...E quanto abbondante � il frammento di PCR?? Ha una buona resa o no??

Quanto carichi su gel dei 50ul di PCR x controllarla prima della digestione?? Io ti consiglierei di caricarne 5ul e renderti conto da qui dell'efficiency della PCR...

io lavorei su questo step...
come dicevi tu, l'enzima taglia solo 1 volta, quindi dovrebbe generare due frammenti od uno solo a seconda del polimorfismo...quindi l'abbondanza del tuo prodotto di PCR sar� dimezzata (o gi� di l�) in un caso...

cercherei di massimizare la processivit� della PCR...

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