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princy
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
 Inserito il - 20 agosto 2009 : 17:55:21
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Ciao a tutti. Ho qualche domanda da porvi..
Sui miei libri c'è scritto che ogni proteina pura corrisponde ad una banda elettroforetica.
Quindi se nel campione ci sono più proteine, nel gel ci saranno più bande.
Dal momento che le proteine si separano formando bande diverse a seconda delle loro dimensioni, se il campione in esame contenesse due proteine diverse ma di dimensioni identiche, non formerebbero insieme un'unica banda dando un falso risultato? Se si, come si procede?
Leggo anche che le subunità di una proteina multimerica corrispondono ciascuna ad una banda.
La domanda sorge spontanea... "come si fa ad avere la certezza che quella specifica banda contenga solo un tipo di subunità e non una subunità della stessa lunghezza della prima, ma appartenente ad una seconda proteina?In teoria potrebbe anche essere una proteina piccola quanto la subunità di un'altra.. Mi sono spiegata bene?
Confido in voi..
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 20 agosto 2009 : 19:21:43
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| Di solito per rilevare una specifica proteina utilizzi un anticorpo marcato per quella proteina. Quindi se l'anticorpo ti mostra una banda alla lunghezza attesa puoi essere praticamente certa che sia la tua proteina. In teoria anche l'anticorpo potrebbe fare una cross-reazione con un'altra proteina della stessa dimensione... ma diciamo che le probabilità che ciò succeda sono molto molto basse. |
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princy
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 21 agosto 2009 : 20:10:42
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Quello di cui parli si chiama western blot, se non sbaglio.. E prima di effettuare l'elettroforesi e il western blot, si applicano altri sistemi per aumentare la purezza del campione o non c'è bisogno?
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 22 agosto 2009 : 09:59:22
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Sì, quello è il western blot. Certo, puoi anche colorare il gel prima di mettere l'anticorpo, ma non potrai distinguere con sicurezza le bande.
Volendo puoi anche purificare il campione prima del wb, ma in generale non serve (almeno, io non l'ho mai fatto). |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 22 agosto 2009 : 10:42:34
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Credo che il tuo libro voglia sottolineare che ogni proteina purificata ha caratteristiche omogenee per cui migra formando una singola banda. Ciò non esclude che due proteine non possano trovarsi sovrapposte o molto vicine.
In realtà capita molto frequentemente, poiché nella cellula ci sono decine di migliaia di proteine, alcune molto simili, ma questo non è assolutamente un problema, poiché come ha già scritto Chick80, si usa un anticorpo specifico per vedere solo quella banda quindi non ti devi porre questo problema.
C'è da precisare che la migrazione delle proteine l'SDS usato serve soprattutto per denaturare e mascherare le cariche della proteina e consentirle di andare verso l'anodo... In questo modo, orientativamente, si ha un rapporto massa/cariche simile per tutte le proteine e quindi dovrebbero migrare in maniera proporzionata alla massa.
Questo però non avviene, poiché a variare la migrazione contribuiscono, tra l'altro, la forma della proteina stessa, la sua sequenza, eventuali fosforilazioni, proline o istidine ripeture, ponti disolfuro etc etc. Tutti questi fattori spostano a volte di poco, a volte di molto il peso molecolare apparente che vedi sul western blot.
Ad esempio io studio una proteina che ha un ponte disolfuro che se non è ridotto fa migrare la proteina a 160 kDa, una volta ridotto migra a 120 kDa, se cambio l'SDS con uno meno puro si sposta a circa 110 kDa, e se fosforilato da un'ulteriore variazione del peso apparente.
Altre due isoforme, praticamente uguali nel peso molecolare, al western blot appaiono l'una a 102 e 105 kDa.
Per cui la banda potrebbe sovrapporsi o meno ad un'altra, ma non è detto che abbiano veramente la stessa massa, e viceversa, due proteine con massa uguale possono dare bande ad altezza diversa.
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