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Sperduta
Nuovo Arrivato



1 Messaggi
Inserito il - 23 agosto 2009 : 11:34:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Sperduta Invia a Sperduta un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti!
io ho un problema con la PCR per lo screening di topi INF-gamma KO: nella PCR uso primer che amplificano l'allele WT e un'altra coppia che amplifica il KO, il problema è che il controllo WT viene identico al controllo eterozigote! Ho provato a rifare la PCR cambiando tutti i reagenti della mix e farla solo su DNA di topi "in teoria" WT ma c'è una forte banda di amplificazione in corrispondenza della banda KO.Questo succede da poco..prima era tutto normale..anche nel controllo bianco c'è l'ombra della banda per il KO! cosa può essere successo?
Grazie..ciao

Neuroscience
Utente



659 Messaggi
Inserito il - 23 agosto 2009 : 14:05:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Cara Sperduta,

questo capita spesso anche a me, ci sono varie possibilità, tuttavia nella maggioranza dei casi il problema è causato dall'uso delle stesse pipette con puntali senza filtro per l'estrazione del DNA dalle code dei topi.
In pratica il DNA genomico è altamente contaminante, ed in maniera paradossale spesso si amplifica molto meglio del campione che usi.

Puoi risolvere cambiando pipette, oppure pulendo quelle che usi, solo le parti in plastica smontabili, in una soluzione decontaminante.

Ovviamente dovresti cambiare anche le soluzioni ed i primers, poiché è probabile che hai contaminato con le pipette anche quelle.

in bocca al lupo
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