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miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 25 agosto 2009 : 15:49:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
salve

sono alla presa con un nuovo clonaggio
ormai sono il tecnico dell'istituto per clonare


clonaggio Blunt

vettore tagliato con 2 enzimi blunt
e l'inseto e' una PCR fatta con primer contenenti gli stessi enzimi
che tagliano il mio vettore

ho defosforilato il vettore dopo la digestione
e ho digerito il prodotto PCR con gli enzimi blunt

faccio ligazione 1:3

nessuna colonia

ora sto leggendo su un sito inglese

That's because PCR product is dephosphorylated after PCR. So, if vector has no 5'-PO4 and insert neither, ligation will never ocurr. Remember it needs both 3'-OH and 5'-PO4.

cosa a me nuova
ma forse e' la spiegazione delle zero coline positive

ora sempre secondo questo sito
dovrei fosforilare i primers prima di fare la PCR

e qui entro in panico!!!

come si fa?

e la seguente domanda e'

ma se non defosforilo il vettore?
otterei colonie positive?
gia so che dovrei analizzare un numero maggiore di colonie
ma se vale la pena....
meglio che fosforilare i primers!!!

che poi non capisco bene...
perche' se tratto il mio prodotto PCR con gli enzimi...
perche' dovrebbe essere defosforilato?????

help




GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 25 agosto 2009 : 16:41:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
mmm se vuoi un protocollo per fosforilare i primers lo trovi qua: Cloning of PCR products with phosphorylated primers

Ma sinceramente non credo che serva nel tuo caso, una cosa non mi torna... se tu tagli il tuo prodotto di PCR con gli enzimi di restrizione non ti serve a niente perché la parte di primer fosforilata la taglieresti via!
Per spiegarmi meglio, questo è il tuo prodotto di PCR:
P-NNNNNNNNnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnNNNNNNNN
  NNNNNNNNnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnNNNNNNNN-P

che tagliato sarebbe:
P-NN                                            NNN
      NNNNNNnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnNNNNN
      NNNNNNnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnNNNNN
  NN                                           NNN-P



Diversa sarebbe la questione se tu clonassi il prodotto di PCR così com'è, allora avrebbe anche senso fosforilare i primers. (anche a me giunge nuova, ma non ho mai fatto clonaggi blut!)

Forse dovresti valutare altri metodi per aumentare l'efficenza della tua ligazione, tipo aumentare la quantità di ligasi, aumentare il tempo di reazione o utilizzare un buffer di ligazione che contenga PEG.

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Neuroscience
Utente



659 Messaggi

Inserito il - 25 agosto 2009 : 17:03:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Verifica prima l'efficienza del taglio blunt sulla tua PCR
Sei sicuro che sia avvenuto il taglio? Quante basi di protezione ci sono? Purifichi il prodotto di PCR?
I frammenti di DNA provenienti dalle PCR sono fosforilati di sicuro, sono solo i primers a non essere fosforilati.
Peraltro GFPina ha perfettamente ragione, il taglio eviterebbe ogni questione

Test semplice per verificare se tagli correttamente la PCR con l'enzima è
PCR con taq->purificazione della banda->taglio con enzima->purificazione->ligasi 5 minuti->controllo su gel
se i tuoi frammenti polimerizzano allora il taglio è fatto bene, altrimenti c'è qualcosa che non va
Test semplice che puoi fare in un paio di ore al massimo.

Poi dovresti considerare anche altre cose, se il frammento di PCR è piccolo e non usi opportune cautele puoi avere facilmente la sua denaturazione.

Io controllerei prima queste cose, poi in seguito controllerei anche la trasformazione con un controllo positivo.
L'assenza completa di qualsiasi colonia mi insospettisce sempre, meglio essere sicuri

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miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 25 agosto 2009 : 17:41:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao

concordo con te GFPina che se taglio... non serve fosforilare i primers
grazie per avermi tolto il dubbio

il prodotto PCR e' grande (1500pb)
quindi non si dobrebbe degradare facilmente

inoltre io faccio il clonaggio immediatamente
in un giorno faccio PCR (con Pfu)... poi digerisco... poi purifico e reazione di ligasi O/N
non credo abbia il tempo di degradarsi
almeno spero

Neuroscienze scirve
"L'assenza completa di qualsiasi colonia"

no no di colonie ne ho
poche ma ci sono
ma tutte negative... senza inserto

per le basi di protezione ogni primers ne ha 3
dovrebbero essere ok

mi sfugge una cosa del test per vedere se i miei enzimi tagliano il prodotto PCR
devo fare la ligazione solo del prodotto PCR?

grazie mille

e scarto l'idea di fosforilare i primers
anche a me suonava nuovo la spiegazione che ho trovato








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Neuroscience
Utente



659 Messaggi

Inserito il - 25 agosto 2009 : 19:14:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
uhmm, se usi la Pfu non puoi fare il test che ti ho consigliato, era solo per la Taq.
3 basi di protezione in genere non sono sufficienti, sei sicuro che per il tuo enzima bastino?

Non parlavo di degradazione, ma di denaturazione, apertura della doppia elica quando usi ad esempio acqua distillata invece del TE durante la purificazione.
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miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 26 agosto 2009 : 10:22:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao

beh il test lo posso fare con la taq
rifaccio la Pcr
nessun problema

meglio fare il test che riniziare il clonaggio e non sapere se gli enzimi tagliano

per le basi... si 3 sono sufficienti
non e' la prima volta che disegno primers con enzimi di restrizione
e ho familiarita' in questo e sempre hanno funzionato

il mio capo ha scritto a un gruppo che ha gia usato questo plasmide e ha gia fatto un clonaggio simile
e sembra che anche loro non ottenevano colonie fino a quando hanno fosforilato il prodotto PCR
e tutto ha funzionato
mah! forse e' la il problema

ma come si fosforila un prodotto PCR?
con la T4?
ma io gia faccio la ligazione con la T4
quindi?

non so....

e per la denaturazione
uso sempre TE
non amo usare acqua con DNA

grazie
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Neuroscience
Utente



659 Messaggi

Inserito il - 26 agosto 2009 : 10:34:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
è un altro enzima del fago T4
è la T4 chinasi,

tu usi la T4 Ligasi, sono due enzimi diversi ovviamente

Il protocollo è semplicissimo, lo trovi nelle istruzioni dell'enzima stesso o su internet,
in pratica, buffer, dATP, o dNTP, e T4 kinasi a 37 °C, poi purifichi.
elementare come una digestione, una klenow, o una CIP.

in bocca al lupo

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morgan79
Utente Junior

insuperabile

Prov.: Bari


143 Messaggi

Inserito il - 26 agosto 2009 : 10:38:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di morgan79  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di morgan79 Invia a morgan79 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
posso sapere che enzima usi per amplificare con PCR? Esistono enzimi, come la "hi fidelity expander" della Roche che agginge delle A alla fine dell'amplificazione, come avviene per quasi tutte le Taq, altri come il pfx della Invitrogen che non aggiunge A e la maggiorparte dei prodotti sono perfettamente blunt. Assicurati che tu stia utilizzando un enzima appartentente alla seconda categoria delle sovracitate.

I primer che utilizziamo di solito non hanno l'estremità fosforilata, ma per il clonaggio ne serve solo una (quella del vettore). anche in presenza di un nich dello scheletro zucchero fosfato, la replicazione è possibile. Se pensi che fosforilando il frammento tu possa aumentare l'efficenza allora fallo. Ma sappi che ordinare primer fosforilati costa un bel pò!! allora ti conviene ordinare la polinucleotide chinasi, e fare la reazione in presenza di dATP, un'ora a 37 gradi C e il gioco è fatto.

Spero esserti stato d'aiuto

il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare
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miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 26 agosto 2009 : 12:07:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao

per rispondere a morgan
non intendo ordinare primer fosforilati
mai pensato

se mai li fosforilavo io prima di usarli
GFPina mi aveva detto il protocollo

ma siamo arrivati alla conclusione che e' inutile
visto che io digerisco con gli enzimi il prodotto

e poiche' defosforilo il vettore sembra che con questo clonaggio devo fosforilare il prodotto PCR

cosa che hanno fatto in un altro lab e ha funzionato

uso la Pfu per amplificare il prodotto PCR

quindi per ora provo a fare come hanno fatto nell'altro lab
fosforilo il prodotto PCR

grazie neuroscience per dirmi che la T4 che devo usare e' diversa

avevo il dubbio


ok ora provo a fosforilare il prodotto e vedo se funziona il clonaggio
se no pensavo di non defosforilare il vettore
e avro' piu background ma almeno 1 colinia positiva la dovrei ottenere

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 26 agosto 2009 : 14:15:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scusate ma a me continua a sfuggire un concetto, sarò io... però se tu fosforili i primers o il prodotto di PCR hai lo stesso risultato: prodotto di PCR fosforilato... ma poi lo "tagli"! A che cosa ti servirebbe???
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miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 26 agosto 2009 : 16:30:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
fosforilo il prodotto PCR dopo che l'ho tagliato

come quando defosforili un vettore
prima tagli e poi defosforili

lo stesso faccio con il prodotto PCR
lo taglio
in teoria dovrebbe funzionare cosi perche' dovrebbe essere gia fosforilato

ma sembra che nn e' vero (almeno in questo clonaggio)

quindi lo fosforilo dopo il taglio
e lo purifico

e spero che ottengo colonie positive questa volta




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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 26 agosto 2009 : 20:11:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da miky76

fosforilo il prodotto PCR dopo che l'ho tagliato

Ok mi suona stranissimo... ma ok!

Citazione:
Messaggio inserito da miky76

come quando defosforili un vettore
prima tagli e poi defosforili

Appunto se per il vettore quando lo tagli è fosforilato e lo devi defofsorilare perché per il prodotto di PCR dovrebbe essere il contrario??? Quando lo tagli è defosforilato???



Mi suona sempre comunque tutto molto strano... ma tentar non nuoce!!!

In Bocca al Lupo!!!

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miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 10 settembre 2009 : 11:57:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao

giusto per agiornarvi

ho fosforilato il prodotto pcr dopo averlo digerito con gli enzimi
e per purificarlo... ho fatto una precipitazione in acetato di sodi e etanolo

poi ho usato il tutto per la ligazione con plasmide defosforilato

beh... ho ottenuto il mio clonaggio!!!

assurdo... lo so...
forse una possibile spiegazione e' che precipitando non rimuovo i dAtp
quindi forse basterebbe solo aumentare la concentrazione di atp nel buffer di ligasi e forse otterrei lo stesso il clonaggio

non so...

non ho avuto tempo per provare

ma comunque giusto per dirvi che seguendo il protocollo che non ha molto senso fatto nell'altro lab
ho ottenuto il clonaggio!!!


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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


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Inserito il - 10 settembre 2009 : 13:20:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Mah... il dubbio rimane...
Comunque sono contenta che il clonaggio sia finalmente riuscito!

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Neuroscience
Utente



659 Messaggi

Inserito il - 10 settembre 2009 : 13:49:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
per curiosità
che enzima di restrizione hai utilizzato?
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miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 10 settembre 2009 : 18:20:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ho usato 2 enzimi di restrizione
NruI e EheI
sono entrambi blunt

e l'nserto era una PCR di circa 1500pb
mentre il plasmide e' circa 8000pb

Gfpina concordo con te
io rimango con il dubbio che quel che ho fatto non ha senso

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Neuroscience
Utente



659 Messaggi

Inserito il - 10 settembre 2009 : 18:33:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
EheI mai sentito

ma NruI ?

è stato l'enzima più ba***rdo che abbia mai utilizzato in vita mia!!!!
Non funzionava quasi mai al 100%, ero costretto all'o.n. e più di metà di quello che tagliava non si ligava mai...
Ho incontrato persone che hanno giurato di non comprarlo mai più

può essere veramente che defosforilasse in qualche modo? magari la prox volta tento un saggio di kinasi prima di rilegarlo...

questa me la segno nel caso servisse...

grazie dell'info
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


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Inserito il - 10 settembre 2009 : 19:24:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Neuroscience

può essere veramente che defosforilasse in qualche modo? magari la prox volta tento un saggio di kinasi prima di rilegarlo...

in effetti sarebbe l'unica spiegazione possibile, anche se... ho fatto una velocissima ricerca, fatta in pochissimo tempo e non molto accurata quindi non con molto valore, ma ho trovato solo pubblicazioni dove scrivono di aver defofsforilato dopo taglio con NruI ovviamente il vettore, ma in una anche il frammento (non so bene per che cosa, ho letto molto di fretta). In teoria non avrebbe senso defosforilare se il prodotto di restrizione è già defosforilato... ma certo male non gli fa al massimo non succede proprio niente... quindi non hanno comunque molto valore queste pubblicazione... ... a questo punto sono curiosa!!!
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Neuroscience
Utente



659 Messaggi

Inserito il - 10 settembre 2009 : 19:36:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
giusto per la cronaca ho letto dal catalogo Neb 2002-2003 che ho sotto mano e che utilizzavo al tempo e scrive testualmente
"After 2-fold overdigestion with NruI, <5% of the DNA fragments can be ligated. Of these, >95% can be recut"

Infatti io ordinai NruI dalla Fermentas che garantiva un 'migliore successo' di taglio e ligazione... anche se poi comunque non andava bene.

Un motivo ci sarà affinché il 95% del DNA non si rilega, io pensai a che i le estremità non venissero tagliate correttamente, però... la strada è aperta anche ad altre teorie... contaminazioni, denaturazioni parziali, condizioni non ottimali...
è da escludere che faccia tagli crociati, poiché le bande erano molto nette e specifiche... non escluderei nessuna teoria

quando sento queste cose me le segno sul quaderno e sul catalogo, non si sa mai che possa dare una mano quando mi riservirà
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miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 11 settembre 2009 : 12:03:41  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao

gli enzimi erano nuovi anche a me


e non sapevo che NruI e' cosi difficile
grazie per le info

io ho tagliato seguendo le istruzioni della casa produttrice
fermentas

comunque io se mai docessi riutilizzarlo
seguo la stessa strategia...
fosforilo l'inserto

non so perche' funziona
ma cavollo vincente non si cambia


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