Forum

Nome Utente:
Password:
Riconoscimi automaticamente
 Tutti i Forum
 Laboratorio
 Biologia Molecolare
 Restrizioni
 Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
I seguenti utenti stanno leggendo questo Forum Qui c'è:

Aggiungi Tag Aggiungi i tag

Quanto è utile/interessante questa discussione:

Autore Discussione  

mollichina di pane
Utente Junior

Miyu


121 Messaggi

Inserito il - 27 agosto 2009 : 11:36:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mollichina di pane Invia a mollichina di pane un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti! Spero abbiate trascorso delle buone vacanze!
Avrei una domanda da porvi...
...devo clonare un gene in un vettore. Dopo la reazione di restrizione ho notato che il mio inserto era corso sul gel ad un'altezza superiore di circa 100bp rispetto a quella originaria (mi riferisco all'altezza relativa alla PCR iniziale).
Vorrei sapere se a qualcuno di voi è capitata la stessa cosa e se c'è una spiegazione.
Grazie!

miky76
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 27 agosto 2009 : 13:10:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di miky76 Invia a miky76 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao

scusa ma non ho capito

tu hai fatto una PCR
e poi hai digerito la PCR e hai messo il prodotto nel vettore?

poi hai clonato

e dopo di nuovo hai cortato per vedere se hai colonie positive
e il frammento che ottieni e' 100pb piu piccolo del prodotto PCR originario

ho capito bene?

la domanda (forse stupida) e'
hai cambiato gli enzimi di restrizione per analizare le colonie?
in modo che tagli dentro il prodotto PCR e quindi e' normale che sia piu piccolo



Torna all'inizio della Pagina

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 27 agosto 2009 : 13:45:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
No credo che intendesse che ha fatto la PCR, ha tagliato con ER e poi ha fatto migrare su gel il prodotto della restrizione.
Il prodotto di restrizione migra su gel 100bp in più rispetto al prodotto di PCR originario quindi: tagliato è 100bp più grosso del "non" tagliato!

Domanda: ma il frammento tagliato presenta estremità coesive?
L'unica cosa che mi viene in mente è che le parti a "singolo filamento" possano rallentarne la corsa... ma non saprei, in pratica non ho mai fatto una cosa del genere.
Torna all'inizio della Pagina

mollichina di pane
Utente Junior

Miyu



121 Messaggi

Inserito il - 28 agosto 2009 : 12:54:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mollichina di pane Invia a mollichina di pane un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
E' esattamente come dice GFPina.
Prima di fare la ligation faccio correre su gel l'inserto e il vettore (poi taglio le bande, estraggo e ne ricorro un pochino per quantizzare occhiometricamente tramite confronto con un vettore a concentrazione nota).
Effettivamente l'inserto ha estremità coesive, perchè ho potuto tagliare solo con un enzima (ecoRI)per vari problemi...
La cosa ancora più strana è che dopo il taglio con ER il frammento migra circa 200 bp più in alto. Dopo il taglio della banda e la sua estrazione dal gel con conseguente corsa per quantizzazione, l'inserto migra circa 100 bp più su (cioè si abbassa leggermente ma non in modo tale da avere l'altezza originaria della PCR).
AIUTOOOOO!!!!
Torna all'inizio della Pagina
  Discussione  

Quanto è utile/interessante questa discussione:

 Nuova Discussione  Nuovo Sondaggio Nuovo Sondaggio
 Rispondi Aggiungi ai Preferiti Aggiungi ai Preferiti
Cerca nelle discussioni
Vai a:
MolecularLab.it © 2003-18 MolecularLab.it Torna all'inizio della Pagina