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Dionysos
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Inserito il - 29 agosto 2009 : 14:22:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Buondì
in questo forum s'è parlato più volte dei problemi legati
ad una corretta digestione delle estremità di frammenti di
PCR che s'intende utilizzare come inserti per clonaggio direzionale

Come sappiamo la questione spinosa dell' "avrà tagliato?"
è tra i più noiosi problemi di questo mondo, proprio perchè
è molto difficile escludere categoricamente un'inefficienza
di taglio (anche dopo aver preso gli opportuni accorgimenti
sulla spaziatura del sito di taglio dall'estremità del fragment)

La mia domanda è : secondo voi esiste un metodo per verificare
in modo AFFIDABILE il corretto taglio di entrambe le estremità
di un frammento di PCR ?


o meglio:

conoscete un metodo per escludere in modo affidabile
che problemi di fallimento nel clonaggio siano dovuti
ad una inefficienza di taglio?

Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

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Neuroscience
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Inserito il - 29 agosto 2009 : 14:29:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
sì, se usi una taq, basta fare una ligasi del tagliato, poi carichi su gel

potresti calcolare anche l'efficienza del taglio in qualche modo
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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 29 agosto 2009 : 14:36:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Posso chiederti cosa dovresti vedere su gel per stimare
l'efficienza di taglio? e come mai solo con Taq?


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Neuroscience
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659 Messaggi

Inserito il - 29 agosto 2009 : 14:44:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
questo è un trucco che ho utilizzato spesso per creare dei piccoli geni fluorescenti...

Funziona in questo modo....
Praticamente se fai una PCR con la Taq, i frammenti avranno una A alla fine in entrambi i lati.
Se ci fai la ligasi, non polimerizza.

Se invece lo tagli con un enzima o con due enzimi potresti farla polimerizzare con la ligasi.
Ci sono varie combinazioni che puoi bene immaginare...
ad esempio mettiamo che l'enzima tagli solo ad un lato del frammento di es 200 basi...
io inattivo l'enzima di restrizione o purifico il frammento e poi lo ligo in una quantità tale da poterlo vedere bene sul gel.
A questo punto vedresti una banda singola a 200 basi se l'efficienza è 0,
oppure una sola banda di 400 basi efficienza 100%
entrambe le bande 200bp e 400bp, basandoti sul rapporto delle intensità valuti l'efficienza
ad esempio se l'intensità relativa è uguale avresti un'efficienza del 50% etc etc

Funziona anche se il taglio è blunt

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Dionysos
Moderatore

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Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 29 agosto 2009 : 14:51:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho capito.

Mentre per quanto riguarda le più frequenti situazioni di
doppia digestione simultanea ad entrambi i lati? il metodo
che dici è altrettanto affidabile?

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Neuroscience
Utente



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Inserito il - 29 agosto 2009 : 14:59:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
bhé basta che verifichi un enzima alla volta ;-)

oppure se lo fai per entrambi, dovresti avere un'unica banda altissima con qualche banda strana e sfumata intermedia per la ciclizzazione.
Se non si è tagliato bene, come spesso accade, avrai 200, 400, 600, 800 etc etc
in genere quando si presentano più intense le bande in alternanza, tipo 400, 800, 1200 bp significa che uno dei tue enzimi ha fatto un po' schifo

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Dionysos
Moderatore

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Inserito il - 29 agosto 2009 : 15:25:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Capito tutto.Grazie, proverò a vedere se riesco a metterla in pratica

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Dionysos
Moderatore

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1913 Messaggi

Inserito il - 29 agosto 2009 : 15:30:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Anzi, solo due ultime domande:

> Da quali rese di purificazione (iniziale) del PCR
fragment parti, per poter fare tutte queste operazioni?
Fai una PCR di prova solo per finalità analitiche e poi
la ripeti con finalità preparative per il clonaggio?

> Quanti ng sottoponi a ligazione per poter vedere
in modo chiaro e inequivoco su gel? tutto il digerito purificato?

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(F.W. Nietzsche)

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Neuroscience
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659 Messaggi

Inserito il - 29 agosto 2009 : 15:43:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
bhé dipende, dai
da quanto prodotto hai, da quanto te ne serve etc etc
io facevo clonaggi in vettori, per cui a me 5 ng bastavano per il clonaggio
da una PCR se ne possono ottenere facilmente 500 ng
quindi digerivo e purificavo 200 ng tagliato e 200 ng di controllo
con il restante potevo tentare un sacco di clonaggi... se non tagliava buttavo tutto e ricominciavo

Ma se fai 2-3-10 PCR puoi fare tutti i tentativi che vuoi per vedere come tagliare meglio.

In genere l'occhio umano (così dicono) riesce a percepire in normali condizioni circa 5 ng di DNA al minimo su un gel, ovviamente dipende se la banda è netta, se se esperto etc etc.
Diciamo che io ne mettevo anche più di 100 ng a ligare per evitare che la formazione di più forme di ligazione sopracitate, generavano molte bande a bassissima concentrazione che poi non potevo vedere.

Però dipende da quello che devi fare, sono sicuro che ne saprai fare buon uso
mantieni il segreto però, sulla tecnica ci sono i copyright

in bocca al lupo

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