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gabrycellfactory
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
 Inserito il - 31 agosto 2009 : 15:27:29
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Ho sempre estratto l'RNA da colture cellulari dopo averle staccate con tripsina-EDTA, inattivato la tripsina con PBS-siero, centrifugato e congelato il pellet di cellule dopo averlo risospeso in buffer RLT+beta mercaptoetanolo o in trizol....
Vorrei chiedervi:
1- è vero che la tripsina può dare fastidio in qualche modo?
2- screperare le colture può danneggiare l'RNA?
3- in che altro modo posso staccare le cellule prima di estrarre l'RNA? Avete un protocollo che funziona? ho provato a staccarle con solo EDTA, ma non si staccano neanche con le cannonate!
4- quale metodo di estrazione si può considerare migliore (nelle mie condizioni di colture cellulari che crescono adese)?
5- dopo aver staccato le cellule immergerle in azoto liquido può servire a mantenere l'RNA di buona qualità?
Vi ringrazio!!!!
Gabry
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gabrycellfactory
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 03 settembre 2009 : 14:19:58
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Se avete suggerimenti rispondete per favore!!!
E' urgente!!!!
Sono proprio bloccata!
Grazie!
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 03 settembre 2009 : 15:50:58
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1- sì, ma sono opportune delle condizioni particolari per far funzionare la tripsina, queste sono incompatibili con il protocollo di estrazione di RNA, quindi è ok
2- no
3- dipende dalla coltura, in genere io mettevo direttamente il trizol sulla piastra e poi screpavo, altre cellule si tolgono con il versene.
4- il metodo di estrazione è sempre lo stesso, è il metodo di raccolta cellule che può essere diverso. Prova a togliere il mezzo, lavi un paio di volte con PBS e poi aggiungi direttamente il trizol, screpi etc.
5- l'azoto liquido in genere lo usano per due motivi, a) per conservare l'RNA a lungo termine data la bassa temperatura, b) per lo sbalzo termico, che spacca le membrane cellulari senza danneggiare l'RNA.
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gabrycellfactory
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 04 settembre 2009 : 14:52:02
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Grazie!!!!
Ho guardato per il versene, è praticamente un sale dell'EDTA, dici che è più forte? Se l'EDTA non è sufficiente, può essere che il versene mi dia dei risultati nel staccare le cellule?
Grazie!! |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 04 settembre 2009 : 16:16:09
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dipende dalle cellule,
alcune si staccano con tripsina oppure versene,
altre si staccano solo con una delle due.
La tripsina potrebbe causare la morte cellulare, mentre il versene potrebbe non essere sufficiente per staccare le cellule.
Guarda nel database delle cellule ATCC, e vedi come consigliano loro.
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