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steddy
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 04 settembre 2009 : 16:14:28
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Ciao a tutti,
è ormai da mesi che sto lavorando su una pianta di cui sono depositate in banca dati pochissime sequenze. Sto cercando di costruire una libreria arrichita in microsatelliti ma quando arrivano le sequenze ...puntualmente non trovo microsatelliti!!!!
Ho provato con diversi metodi
1---Digerisco genomico, taglio con ER, lego adattatori, amplifico(con adattatori, prurifico la pcr. Preparo delle membrane su cui spotto l'oligo (es.GA il piu diffuso nelle piante)e faccio il cross link con UV e poi ci ibrido il mio dna digerito.Eluisco amplifico per aumentare il prodotto, introduco in plasmide e trasformo in EColi. Faccio crescere le colonie e quando sequenzio.....
ho un sacco di sequenze ma nessuna contiene il mio microsatellite, quindi la libreria nn si arrichisce
2---Al posto delle membrane uso un kit della promega il Magnosphere con delle beats legate a streptavidina a cui lego l'oligo(GA) biotilinato e su queste ibrido il mio DNA digerito=
nessun arricchimento!!
Ho optato per il kit perchè pensavo di nn riuscire a legare l'oligo alla mebrana ma evidentemente il prblema nn era questo
Consigli , suggerimenti???
Grazie
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Libreria arricchita
Didattica
