PCR: regione genomica ostica

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lalery
Nuovo Arrivato

22 Messaggi

Inserito il - 11 settembre 2009 : 16:08:23

Ciao a tutti!
Ho una regione molto ricca in G-C e non riesco a disegnare dei primers adatti, tutte le coppie che testo, in condizioni di 0-5-10% di DMSO, non mi danno alcun amplificato...

Solitamente le condizioni che utilizzo sono:
-96°C x 30"
-94°C x 15"
- temperatura di annealing dei primers x 30"
- 68°C x 1'
35 cicli
- 68°C x 10'

Cosa posso fare? Esiste un protocollo particolare?

Grazie mille a tutti.

RM
Nuovo Arrivato

115 Messaggi

Inserito il - 11 settembre 2009 : 16:24:06

ci sono molte cose che puoi fare
- aumentare la t di denaturazione (98°C max 20 sec)
- provare primers con alte t di annealing (65-70)
- provare altri adiuvanti (betaina glicerolo) da soli o in combinazione
oppure (forse la cosa migliore) provare delle taq specifiche. Io uso la pfu ultra fusion HS della stratagene che funziona benissimo.
Ciao

lalery
Nuovo Arrivato

22 Messaggi

Inserito il - 11 settembre 2009 : 16:29:53

Grazie per le dritte!
Ho appena trovato un kit qui in lab: GC-RICH PCR System...
Che ne dici? Proverò con questo...

Grazie ancora, ciao ciao!