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Discussione |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
 Inserito il - 13 settembre 2009 : 19:05:43
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Qualcuno sa come posso fare per capire se un determinato
fluorocromo (nel mio caso: phycoerythrin, PE) fa spectral
overlap con un altro di colore simile (mCherry) ?
Vorrei capire se è possibile usarli assieme
per un'analisi citofluorimetrica OPPURE per una
co-immunofluorescenza su vetrino (riuscendo a
distinguere le singole marcatura dalla doppia marcatura)
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Gabriele
Utente
Prov.: Pisa
Città: Pisa
615 Messaggi |
Inserito il - 13 settembre 2009 : 20:06:21
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| Credo che soltanto il confronto degli spettri di assorbimento e di emissione possa chiarire la questione. |
"Chi rinuncia alla libertà per la sicurezza, non merita né la libertà né la sicurezza. E finirà col perdere entrambe." |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 13 settembre 2009 : 20:12:33
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concordo,
aggiungerei che la ricerca di qualche riferimento bibbliografico non guasterebbe...
ti consiglierei inoltre di chiamare la ditta che li vende e di chiedere a loro
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 13 settembre 2009 : 22:22:19
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| Ricorda che anche se gli spettri non si sovrappongono puoi comunque avere color bleeding. Dipende non solo dagli spettri, ma dai filtri che usi, dall'intensità della fluorescenza (e questo è molto importante nel tuo caso visto che probabilmente non potrai controllare il livello di espressione di mCherry), dalla potenza della lampada/laser che usi etc. |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 14 settembre 2009 : 01:24:02
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Urca quante cose. Io mi annoto tutto: in fondo ho un anno per imparare.
Solo un'ultima domanda: guardando lo spettro riportato da GFPina sembra
che la CFP e la GFP abbiano un overlap considerevole, EPPURE pare che in
diversi lavori (tra cui uno che conosco bene) sia stata usata una doppia
marcatura CFP + GFP senza problemi di compensazione... c'è una spiegazione
semplice/ovvia che mi sfugge?? |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 14 settembre 2009 : 09:19:12
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Ci sono metodi di spectral deconvolution che ti permettono di separare ad es. CFP, GFP e YFP nello stesso campione.
Ad es. puoi usare il sistema META di Zeiss (ce ne sono anche altri).
In alternativa si possono usare opportune varianti delle xFP e combinazioni particolari di filtri di emissione / eccitazione. Inoltre è molto importante ricordardi che hai un aumento di bleedthrough se fai un capture dei 2 fluorofori allo stesso tempo invece di farlo in sequenza. |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 14 settembre 2009 : 16:00:04
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Dunque, considerando che io sono un novizio assoluto e non saprei
pianificare analisi di quel genere neppure in linea puramente teorica
(non faccio ancora l'esperimento in pratica) che ne direste a riguardo
della 'feasibility' di un'analisi FACS multipla in cellule esprimenti
contemporaneamente tutti e tre questi reporter genes:
> dGFP (destabilized green fluorescent protein)
> deltaNGFR (-> Ab PE-coniugato)
> optimized BFP (blue fluorescent protein)
(ho rinunciato alla mCherry)
Immagine:
19,92 KB
In letteratura non ho trovato riscontri |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 14 settembre 2009 : 23:38:22
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Ok, thanks. Immagino che ci voglia uno strumento di ultima generazione tipo questo.  |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 15 settembre 2009 : 08:13:20
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| Dimenticavo di dire: non ho mai usato un FACS in vita mia... però alla fine che tu stia usando un confocale (quello l'ho usato!) o un FACS il principio della fluorescenza sempre quello è! |
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Fluorocromi: compatibilità
Didattica e Relazioni
