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Xantofilla
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
 Inserito il - 20 settembre 2009 : 01:24:30
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Ciao a tutti! Scusate la mia ignoranza, volevo chiedervi una cosa che non capisco: se io devo estrarre il DNA genomico da un organismo vegetale, utilizzando un kit di estrazione Fermentas e seguendo tutte le procedure per l'eliminazione di proteine e polisaccaridi ecc ecc... quand'è che l'RNA viene eliminato?
I passaggi fondamentali mi pare siano:
-Aggiunta Lysis solution (denaturazione delle proteine di membrana)
-Bagnetto termostatico a 65°C e poi aggiunta cloroformio (eliminazione proteine restanti e polisaccaridi)
-Centrifugazione e separazione del surnatante acquoso con il DNA
-Aggiunta di Precipitation solution e poi di etanolo, che fanno precipitare il DNA con formazione del pellet bianco sul fondo della provetta.
Mi sfugge appunto in quale di questi passaggi il fatto avvenga :(
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 20 settembre 2009 : 01:31:15
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| Non conosco il kit in questione, ma in genere se si vuole DNA RNA-free si fa un trattamento con RNasi. Molti kit lo mettono come passaggio opzionale. |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 20 settembre 2009 : 02:39:09
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Nei passaggi perdi l'RNA perché
1) si degrada per eccesso di ioni e di pH del lysis (forse è presente anche l'enzima RNasi come ha scritto GFPina) e di temperatura (65°C è troppo per la stabilità dell'RNA che si autodegrada)
2) poi perdi i tratti di DNA/RNA molto piccoli durante i passaggi successivi (centrifugazione, separazione, precipitazione in alcool isopropilico a basso rapporto e lavaggi con etanolo)
in altre parole estrarre l'RNA è generalmente una cosa molto difficile, poi nelle piante lo è ancora di più.
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 20 settembre 2009 : 02:55:52
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| Si ovviamente, come fa notare Neuroscience, mi ero dimenticata di aggiungere che è molto più facile ottenere il DNA che non l'RNA che è molto più soggetto a degradazione. Inoltre "spesso" non è necessario avere un DNA libero da RNA, mentre è molto più vero il contrario. |
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Xantofilla
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 20 settembre 2009 : 11:16:39
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Grazie mille ad entrambi, siete stati chiarissimi! :)
Ah già, mi chiedevo un'altra cosa: se io voglio identificare un organismo (mediante l'uso di marker molecolari (poniamo sempre di untilizzare un'alga) e ad un esame macroscopico riconosco l'alga come appartenente ad un probabile genere, come faccio a scegliere i marker da utilizzare? Cioè, perchè alcuni vanno bene per determinate specie, anche se mettiamo che il genere sia presente in tutti i gruppi algali? Esiste una "specie tipo" per ogni marker utilizzato? Spero di essere stata chiara nell'esposizione della domanda.. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 20 settembre 2009 : 12:07:21
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Sinceramente non ho capito benissimo la domanda, e non ho mai studiato alghe, comunque immagino che ci siano markers specifici di ogni specie.
Oppure una situazione di questo tipo:
- specie A: ha i markes 1,2
- specie B: ha i markes 1,3
- specie C: ha i markes 2,3
analizzando questi tre markers riconosci la specie. |
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marok
Utente Junior
150 Messaggi |
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Estrazione DNA
Didattica
