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nomis
Nuovo Arrivato
Città: roma
16 Messaggi |
 Inserito il - 06 ottobre 2009 : 13:03:26
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ciao a tutti ho un problema. qualcuno sa darmi informazione su come si interpretano le letture al facs del ciclo cellulare (cellule colorate con il PI)?
grazieeeeeeeeee
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 20 ottobre 2009 : 21:36:43
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Nomis, mi dispiace non poterti aiutare: anche io ho il tuo stesso problema! non riesco a trovare un libro o una qualsiasi altra fonte ke spieghi chiaramente come interpretare i miei risultati (ke per di + sono altamente variabili!).
Mi limito quindi a rilanciare latua domanda... sperando ke qualcuno con più esperienza di noi rsponda.
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Ascoltami con gli occhi... |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 20 ottobre 2009 : 22:59:30
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| in che senso interpretare?è un po' lunga come cosa poi senza il citometro davanti è anche più complicato..online si trova materiale es http://sciencepark.mdanderson.org/fcores/flow/files/DNA_PI.html non so cosa dobbiate fare ma in generale una volta discriminati i doppietti la faccia del ciclo cellulare in acquisizione è abbastanza classica..per l'analisi se usate ModFit generalmente spiega tutto il manuale |
Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2009 : 20:30:32
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la_fra, grazie per la risposta tempestiva.
Il sito ke ci hai girato mi sembra molto + completo di quelli che mi era capitato di leggere a me... di certo ci vuole un po' di tempo per spulciarlo!
Inooltre hai ragione: sono stata a dir poco vaga.
Nel mio caso vorrei mettere in evidenza mediante FACS con PI staining una differenza di proliferazione tra cellule appartenenti a diverso genotipo.
Nel mio caso un'ulteriore complicazione (oltre al fatto ke io sono totalmente estranea al FACS per ora) deriva dal fatto ke uso cellule in coltura primaria: fibroblasti embrionali murini. Sono molto appiccicosi, quindi fanno agglomerati di cellule che intasanoil FACS o comunque possono falsare l'analisi.
Sono aperta ad ogni suggerimento, libro o link che può essermi d'aiuto.
Grazie fin da ora! |
Ascoltami con gli occhi... |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2009 : 22:34:07
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Anche noi lavoriamo su colture primarie, ma se usi provette di polipropilene e le fissi minimizzi molto il rischio di clump, che oltre a rischiare di intasarti il citometro ti sballano completamente il segnale del PI. Risospendi in PBS+EDTA spipettando bene e poi aggiungi 3 volumi di EtOH assoluto freddo, goccia a goccia e vortexando nel frattempo in modo da avere alle fine le cells risospese in EtOH 70%, che rimane a -20°C fino al momento di colorarle col PI. Voi come preparate il campione? |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 23 ottobre 2009 : 21:06:11
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In ogni caso sono davvero intenzionata a provare a fissarle così some mi hai spiegato.
Potresti dirmi la concentrazione di EDTA che usi in PBS?
Se ho capito bene, devo aggiungere EtOH a goccia MENTRE VORTEXO? Inoltre, come lo aggingi l'Ip poi?
Dopo averle così fissate, come aggiungi la soluzione con IP?
(se non è troppo disturbo... mi daresti anche le componenti della soluzione contenente IP?).
Grazie 1000 per l'aiuto!
Ah, inoltre noi usiamo delle provette di vetro da FACS, che non credo siano quelle di polipropilene a cui tu accennavi  |
Ascoltami con gli occhi... |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 23 ottobre 2009 : 22:57:11
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Le fissi nei tubi da 10-15 ml di polipropilene perchè si appiccicano meno le cells alle pareti..non uso i tubi al momento della fissazione semplicemente perchè come ho scritto nell'altro post puoi fissare le tue cells e colorarle anche dopo settimane, quindi nel frattempo le tieni in freezer..e quindi chiuse in una provetta ma la cosa più importante è il vortexare quando aggiungi l'etanolo, solo così riesci ad avere una sospensione omogenea. Avevo postato il protocollo l'anno scorso, http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=8506, dopo aver lavato via il fissativo trasferisci le cells nei tubi da FACS e le colori lì..ah mi sono accorta ora di aver scritto di risospendere il pellet in 1 ml di EtOH anzichè 1 ml di salina, sorry  . Per l'EDTA devo vedere |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 23 ottobre 2009 : 23:48:29
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| mi associo alla richiesta di chick80 nell'altro post, la_fra perché non inserisci questo protocollo nella sezione protocolli? |
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nomis
Nuovo Arrivato
Città: roma
16 Messaggi |
Inserito il - 28 ottobre 2009 : 16:40:27
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grazie la_fra per il suggerimento del sito. I miei esperimenti sono di confronto di celluledi varie linee tumorali che a seguito di trattamento proliferano di più o di meno. ho ptovato a starvarle in assenza di siero ma non ho avuto risultati netti di un singolo picco in g1. poi siccome ho fermato le cellule a più tempi proprio per cercare le diverse fasi del ciclo mi accorgo che i picchi g1 e g2/s non stanno sempre a 200 e a 400... quindi come li devo considerare? a volte il picco è molto più spostato sulla destra del grafico (per capirci potrebbe cadere verso i 500) e mi chiedevo perchè?
per quanto riguarda il protocollo anche io fisso le cellule sul vortex mentre aggiungo l'et-oh al 70% e poi le tengo a -20 fino a quando non le coloro.
grazie a tutti |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 01 novembre 2009 : 13:02:08
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Ciao io non ho mai dovuto starvarle (termine terrificante  ) però vedo che per quantitativi di FBS e tempi ognuno dice la sua, prova a cambiare quelli..poi se lavori su MCF-7 o altre linee di breast cancer usa phenol red-free medium, perchè mima la struttura dell'estrogeno e quindi ti annulla parzialmente l'effetto della serum starvation (ovviamente se hanno il recettore, infatti per le MDA-MB-231 non cambia nulla). Riguardo ai picchi, su linee tumorali difficilmente sono belli precisi a 200 e 400 come per linfociti o simili, generalmente perchè sono cellule iperdiploidi o poliploidi e la popolazione non è omogenea..forse il fatto di avere il G2 spostato può essere dovuto a questo e al fatto che non avendo la popolazione sincronizzata non hai il doppio del DNA in quella fase..
EDIT: ho trovato questo guarda i suggerimenti, è per FlowJo ma il principio è lo stesso http://flowlab.dfci.harvard.edu/pdf/CellCycle.pdf |
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lettura al facs!!!!!
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