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 smear nella corsa elettroforetica del western blot
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biolala
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Città: Pisa


16 Messaggi

Inserito il - 14 ottobre 2009 : 10:13:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di biolala  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di biolala Invia a biolala un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti!
Da alcuni giorni nella mia corsa elettroforetica del western blot vedo, a partire da metà del gel, che i miei campioni formano tipo uno "smear", cioè il blu di bromofenolo non mi fa vedere una linea bella dritta, ma distorta e staccata dal fronte!
Ho provato a:
- mettere i Tris che uso per fare i gel in frigo e con il pH giusto
- cambiare loading buffer
- rifatto tantissime volte il running buffer
Qualcuno mi sa dare qualche spiegazione di questo fenomeno?

Grazie
Buona giornata e buon lavoro

biolala

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11292 Messaggi

Inserito il - 14 ottobre 2009 : 11:27:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Fai tu i gel o usi dei precast?
A che voltaggio e che temperatura fai andare la corsa?

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biolala
Nuovo Arrivato


Prov.: Pisa
Città: Pisa


16 Messaggi

Inserito il - 14 ottobre 2009 : 11:49:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di biolala  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di biolala Invia a biolala un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Lo faccio io secondo il protocollo preso dal Maniatias.
Inizio con un Voltaggio di 80 per tutto lo stacking poi aumento di 20 V ogni 10-15'...fino ad arrivare a massimo 180V. Temperatura ambiente...solo il running buffer che metto sta a 4°C...

biolala
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


7890 Messaggi

Inserito il - 14 ottobre 2009 : 12:01:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
mmm ma lo smear più che uno smear assomiglia ad una nuvoletta diffusa?
L'unica cosa che mi viene in mente al momento è campioni ricchi di lipidi che possono dare problemi di questo tipo, che campioni usi?

GFPina ^_^

GFPina non Pina!!! (GFP)

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biolala
Nuovo Arrivato


Prov.: Pisa
Città: Pisa


16 Messaggi

Inserito il - 14 ottobre 2009 : 12:46:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di biolala  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di biolala Invia a biolala un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
cellule muscolari scheletriche

biolala
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


7890 Messaggi

Inserito il - 14 ottobre 2009 : 14:37:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da biolala

cellule muscolari scheletriche

Ok allora dubito che si tratti di lipidi in questo caso, a me era capitato con lisati di cervello.
Bisognerebbe capire bene com'è questo smear e cosa influenza, hai provato a colorare il gel (o la membrana se hai blottato) per vedere com'è la migrazione delle proteine?
Osservi la stessa cosa solo nei campioni o anche nello standard?
Prima veniva normale e ora hai questo problema? Hai cambiato qualcosa?
Il problema potrebbe essere anche il buffer di lisi che utilizzi per i tuoi campioni, è sempre lo stesso o hai cambiato qualcosa qui?

GFPina ^_^

GFPina non Pina!!! (GFP)

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biolala
Nuovo Arrivato


Prov.: Pisa
Città: Pisa


16 Messaggi

Inserito il - 14 ottobre 2009 : 14:43:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di biolala  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di biolala Invia a biolala un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il gel l'ho colorato è le bande si vedono bene...non vorrei che questo mear o meglio come hai detto tu GFPina "nuvoletta" possa interferire con una buona corsa dei campioni.
Il buffer di lisi è il Laemmli buffer...non credo sia quello il problema!

biolala
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Gst
Utente Junior


Prov.: Roma
Città: Ariccia


143 Messaggi

Inserito il - 27 ottobre 2009 : 20:53:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gst Invia a Gst un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao Biolala.

Io nn so perchè ma a "naso" il problema mi sembra + dovuto al gel/corsa elettroforetica che ai campioni.

Io proverei a fare NUOVI i tris cn cui prepari il gel (spesso, cn il tempo, i sali al loro interno si concentrano), ripreparerei l'SDS che metti nel running buffer (spesso va incontro a precipitati, o forse è stato preparato alla % sbagliata per errore). Punterei su queste componenti perchè sono molto importanti per la corretta riuscita del gel ed inoltre sono poco costose da sostituire.

Inoltre controllerei il variare dell'amperaggio durante la corsa. Controlla che rispetti l'andamento di sempre ( e comunque che non salga troppo). Se l'andamento dell'amperaggio sviluppato è diverso da quello solito (che osservavi prima dell'insorgere di questi problemi), inizierei a dubitare anche dell'alimentatore o dell'aparato di corsa.

Buona fortuna.

Ascoltami con gli occhi...
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