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biologomolecolare84
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 Inserito il - 22 ottobre 2009 : 00:09:16
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Ciao a tutti, non sono riuscito a trovare molto in rete e quindi chiedo aiuto a voi. Sto preparando Biologia Cellulare II e mi sono trovato tra le mani un articolo in cui parlano di un saggio chinasico fatto sulle cicline D/CDK4,6 - E/CDK2 - A/CDK2. Nell'articolo c'è scritto che il substrato usato è una proteina di fusione GST-Rb. il complesso di cicline D-E/CDK4,6-2 fosforilano la Rb permettendo il rilascio del fattore E2F che è adesso libero di attivare la trascrizione. Non ho capito come avviene il passaggio...cioè come posso misurare la fosforilazione (o vederla mediante WB usando l'anti-GST-Rb)?credo mi manchi un passaggio...grazie a chiunque sia in grado di aiutarmi.
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chick80
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biologomolecolare84
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Inserito il - 22 ottobre 2009 : 13:36:52
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Si, scusami. L'articolo a cui mi riferisco è il seguente:
Integrin-Specific Activation of Rac Controls Progression through the G1 Phase of the Cell Cycle
Molecular Cell, Volume 8, Issue 1, Pages 115-127
A. Mettouchi, S. Klein, W. Guo, M. Lopez-Lago, E. Lemichez, J. Westwick, F. Giancotti
Mi sono bloccato alla prima figura (1A). In pratica ho capito cosa vuole dire e ne ho compreso il significato (è banale) ma mi piacerebbe anche conoscere la strategia che hanno utilizato per il saggio chinasico con la GST-Rb e l'istone H1; sai...in caso alla prof. venga in mente di chiedermelo e cmq per conoscenza personale.
Grazie mille. |
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biologomolecolare84
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Inserito il - 22 ottobre 2009 : 16:38:34
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| Forse nella mia testa ho solo complicato il problema...potrebbe trattarsi di un semplice pull-down. no? E il rado di fosforilazione è ottentuto utilizzando ATP con il P in gamma radioattivo, giusto? |
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rabid
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3 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2009 : 16:53:54
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ciao,
a parte che i materiali e metodi di quel paper sono scritti malissimo,
l'esperimento in figura 1A è quello che dici tu.
immunoprecipitano CDK/cyclin da un estratto di cellule e incubano l'immunoprecipitato con due substrati Rb (fuso al GST) oppure istone H1 e aggiungono certamente ATP marcato con 32P in gamma. l'attività chinasica viene misurata grazie all'incorporazione di fosforo radioattivo nel substrato
spero ti sia utile
ciao |
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biologomolecolare84
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Inserito il - 24 ottobre 2009 : 17:32:18
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| Ciao, grazie...non mi era così chiaro in che modo usano l'istone H1. Grazie ancora..ciao |
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Saggio chinasico GST-Rb
Didattica
