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Soshi Fujiwara
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 Inserito il - 22 ottobre 2009 : 23:15:57
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Si, io ho provato, ma credo che sia necessario distinguere il primer walking dall'asymmetric-PCR.
Quella a cui ti riferisci tu, ovvero la reazione di PCR su singolo filamento, è detta Asymmetric-PCR, in cui l'amplificazione non è esponenziale, ma bensì lineare.
Secondo molti protocolli letti su internet un'Asymmetric-PCR non differisce molto da una PCR normale, semplicemente uno dei due primer è sbilanciato rispetto all'altro. Per la precisione il primer posizionato sul filamento da estendere è in concentrazione maggiore.
Secondo il protocollo che avevo io tale sbilanciamento doveva essere in rapporto 50:1 tra i due primer. Il programma di PCR deve avere più cicli rispetto al normale, almeno 50, per sopperire alla linearità del processo.
In generale ti consiglio di utilizzare primer molto più ricchi in GC rispetto al normale, almeno 60-65% e con una T°annealing molto vicina a quella a cui lavora la TaQ (magari per fare una PCR a due steps anzichè 3). La specificità del primer da estendere è un punto cruciale del meccanismo. Ovviamente per l'elongation devi scegliere un tempo consono alla TaQ che utilizzi. Tieni conto che maggiore è l'elongation, maggiore sarà l'estensione del primer sul genoma, ma contemporaneamente la TaQ perderà prima di efficienza. Di conseguenza anche le unità di TaQ da utilizzare dovranno essere maggiori.
Ti conviene fare piccoli passi per più volte.
Parere= l'ho fatto diverse volte, ma ho lasciato perdere per due motivi:
1. non era possibile costruire un primer così specifico sulla mia sequenza poichè ero su una zona di 200bp piena zeppa di AT-
2. Per ovviare a questo problema ho provato con il vero Primer Walking, quello in cui si taglia con enzimi di restrizione, si legano gli adattatori e poi si fanno delle nested sulle nested con adaptor primer e primer specifici.
Nonostante tutto cercai di applicare ugualmente l'Asymmetric-PCR con un primer con annealing@52°C (il max che potei ottenere), ma ottenni 13 bande di altezze diverse e nessuna di queste, sottoposta ad una nested PCR con primer interni specifici fornì il risultato atteso (dovevano essere di 100bp e invece erano tutte oltre i 250...mah? Misteri della biologia molecolare).
Ciò però non significa che la tecnica non funzioni, infatti scoprii che il problema era altrove: la zona che volevo estendere del genoma era una sequenza altamente conservata per una particolare famiglia proteica e quindi i miei primer attaccavano altri mille loci oltre a quello di interesse. Avrei potuto avere anche un annealing@70°C del primer, ma non sarebbe servito a niente! 
In definitiva se il tuo scopo è quello di ottenere un'estensione di un frammento di DNA sul gDNA a partire da un primer io ti consiglio la seconda tecnica, che per quanto mi riguarda ha funzionato a perfezione e la ritengo anche più affidabile (vedi problematiche legate alla specificità che ho citato).
Ciò non toglie che nel libro "Ballando nudi nel campo della mente" l'autore Kary Mullins parla proprio del fatto che prima della sua invenzione la gente si divertiva tranquillamente a fare amplificazioni con singolo primer quindi evidentemente l'Asymmetric-PCR funziona (perchè non dovrebbe del resto?), o almeno funzionava prima del 1993!
Però in letteratura non ho trovato molto a riguardo.
Se qualcuno volesse suggerire protocolli migliori per fare l'Asymmetric-PCR la sperimentazione, per quanto mi riguarda, è apertissima poichè il Primer Walking è efficace, ma si rivela una tecnica lunga, laboriosa e in parte anche costosa.
Spero di aver chiarito almeno in parte i tuoi dubbi e mi scuso se mi sono dilungato troppo. |
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