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daruma
Nuovo Arrivato

Città: Stuttgart


12 Messaggi

Inserito il - 29 ottobre 2009 : 15:08:41  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di daruma Invia a daruma un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti,

avrei bisogno della vostra perizia per risolvere un problema. ho necessita' di fare una 5' e una 3' RACE per sequenziare un gene di una pianta. ora, nella genebank (NCBI) la sequenza di questo gene esiste, ma (piccolo problema) e' una sequenza di DNA genomico, e non di cDNA (che invece non esiste nella genebank). tra l'altro la sequenza di genomico e' quasi completa (circa l' 85%). ora, ho provato a fare delle PCR standard con dei primers disegnati sulla sequenza di genomico (come detto, l'unica a disposizione...) con il cDNA della pianta. e ho qualche problema. il primo pensiero e' che dipenda dallo splicing a cui l'RNA maturo va incontro perdendo le sequenze introniche... ma io non so dove sono gli esoni e dove sono gli introni del gene, quindi... come faccio? come faccio a disegnare i primers a cavallo di due esoni usando la sequenza di genomico senza sapere quali sono le regioni codificanti del gene (esoni)? premetto che i primers funzionano con il DNA genomico, ma con il cDNA sono circa 1/3 della lunghezza originaria... in realta' le bande si vedono, ma appunto la grandezza degli ampliconi non e' piu' quella... vi sarei immensamente grato se poteste aiutarmi a risolvere questo problema!

Soshi Fujiwara
Nuovo Arrivato

Soshifujiwara



60 Messaggi

Inserito il - 29 ottobre 2009 : 18:21:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Soshi Fujiwara Invia a Soshi Fujiwara un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Spero di non rispondere in modo troppo banale, ma non ti sarebbe utile sequenziare il cDNA che hai e fare un confronto?

In alternativa potresti usare dei software per fare una predizione degli introni sulla sequenza di Dna genomico che hai e fare dei tentativi di primer. Magari aiutandoti anche con Mfold.

Se devi fare una 3'RACE puoi usare direttamente il poli-dT con un primer specifico e fare una PCR mentre invece per la 5'RACE vendono dei kit oppure puoi farti fare degli adattatori (occhio alle estremità che devono essere defosforilate e a quelle che devono contenere i gruppi amminici per evitare l'aggregazione degli adattatori tra di loro) e fare una ligation al tuo cDNA.

Il fatto che le amplificazioni su cDNA ti mostrino bande più basse mi sembra abbastanza banale: o i tuoi primer si attaccano ad altro oppure prendi dentro degli introni che chiaramente vengono rimossi nell'mRNA e quindi non li vedi sul cDNA (la seq risulta più corta..).

Faccio delle ipotesi, magari non ho centrato il problema, è che non ho ben capito la tua spiegazione..

Tutto ciò che esiste ed è in questo mondo,
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ogni cosa esista come deve.
Or ora così sia norma!
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daruma
Nuovo Arrivato

Città: Stuttgart


12 Messaggi

Inserito il - 29 ottobre 2009 : 20:31:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di daruma Invia a daruma un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie della risposta. per la 3' RACE devo appunto avere un primer specifico, e ce l'ho, pero' disegnato sulla sequenza di genomico... i primer si attaccano al posto giusto, ho fatto i blast e il gene e' quello... sui software non sono a conoscenza, ho cercato questo che mi hai detto tu ma non lo conosco.
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 29 ottobre 2009 : 21:14:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh concordo con Soshi Fujiwara.
Ma non hai neanche idea della sequenza della proteina, oppure se lo stesso gene è presente in qualche altra pianta di cui è nota anche la sequenza del cDNA?
In questo caso potresti risalire almeno in parte alla sequenza del cDNA e cercare di disegnare dei primer più specicifi.

Sul fatto che ti vengano bande più corte da cDNA rispetto al genomico, concordo che può essere perchè nel genomico amplifichi una regione che contiene anche introni mentre nel cDNA no e quindi risulta più corto.

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Soshi Fujiwara
Nuovo Arrivato

Soshifujiwara



60 Messaggi

Inserito il - 30 ottobre 2009 : 00:07:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Soshi Fujiwara Invia a Soshi Fujiwara un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
La situazione mi è un pò più chiara e provo a darti qualche suggerimento su alcune info in più che magari puoi riuscire a trovare.

Innanzitutto di seguito ti lascio il link di Mfold: http://mfold.bioinfo.rpi.edu/
Con questo software puoi vedere se il tuo cDNA o RNA (comunque molecola a singolo filamento, dipende cosa scegli di analizzare nel menu sulla destra) forma delle strutture hairpin che limiterebbero, ad una determinata T° l'annealing dei tuoi primer.
Puoi usarlo anche con i primer stessi, per verificare che alla temperatura a cui lavori non formino degli haripin e quindi non funzionino come innesco.

Parlando sempre di primer: sei sicura che i primer che hai disegnato non facciano annealing tra di loro alla temperatura di annealing a cui lavori?

Parliamo della faccenda primer e introni.
Mi pare di capire che tu non riesca a trovare un primer adatto da accoppiare con il poli-dT per fare la 3'RACE sul cDNA. Il primo parere è di fare come ti ha suggerito GFPina, ovvero di cercare geni simili in specie diverse. A meno che non si tratti di geni davvero esclusivi (resistenze a patogeni specie specifici per esempio) dovresti trovare qualcosa che ti può aiutare.
Se è una specie molto sudiata (Arabidopsis, vite, solanacee...) invece potresti fare un blast del tuo cDNA sulle EST della specie in questione.
In alternativa a tutto ciò puoi sempre provare l'approccio più "grezzo": salvi la tua sequenza di DNA genomico e con il comando "TROVA" del tuo editor di testo provi a vedere se trovi le sequenze tipiche degli introni (è noto che in tutti i casi gli introni iniziano con la sequenza GU e terminano con la sequenza AG sull'mRNA, e che tali sequenze sono molto ripetute all'interno dell'introne stesso). Al che cerchi di abbozzare. Certo non è un metodo troppo scientifico, ma l'esperienza insegna.

Se te la vedi proprio malissimo, ma non sono sicurissimo, penso che il programma VectorNTI (ma forse anche Bioedit) ti permetta di fare un "intron predition" e un "Find ORF" che magari potrebbero aiutarti a capire meglio quali zone del DNA sono esoniche quali no.

Al momento non mi viene in mente altro, al massimo ti riscrivo.
Facci sapere!

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daruma
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Inserito il - 30 ottobre 2009 : 19:07:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di daruma Invia a daruma un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti, grazie mille dei consigli. avrei trovato una sequenza di mRNA per il gene che mi interessa nel riso... chissa' forse potrei provare. una cosa: come si procede per disegnare i primer su una sequenza di mRNA dovendoli usare su un cDNA? e' corretto fare il forward primer che segue la sequenza dell'mRNA e il reverse complementare alla sequenza di mRNA? e' la prima volta che mi cimento in una cosa del genere... grazie!
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


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Inserito il - 30 ottobre 2009 : 19:18:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da daruma

come si procede per disegnare i primer su una sequenza di mRNA dovendoli usare su un cDNA? e' corretto fare il forward primer che segue la sequenza dell'mRNA e il reverse complementare alla sequenza di mRNA?

Si esatto fai così, esattamente come faresti per una sequenza di DNA!
Un altro consiglio è quello di disegnarli a cavallo tra 2 esoni in modo da evitare che si leghino anche al DNA genomico.
Poi puoi anche utilizzare il comodissimo tool di NCBI per disegnare i primers: Primer BLAST

è decisamente molto comodo!

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daruma
Nuovo Arrivato

Città: Stuttgart


12 Messaggi

Inserito il - 30 ottobre 2009 : 19:44:03  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di daruma Invia a daruma un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ok ci provo, grazie! una cosa: come faccio a capire quali sono gli esoni e quali gli introni?
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 30 ottobre 2009 : 19:55:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Gli introni ovviamente non ci sono nella sequenza di mRNA, ma in genebank è segnato dove inizia e dove finisce ogni esone.
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daruma
Nuovo Arrivato

Città: Stuttgart


12 Messaggi

Inserito il - 30 ottobre 2009 : 19:59:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di daruma Invia a daruma un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
e dove? dove c'e' scritto ad es. 10..932 o qualcosa del genere? significa che un esone inizia a 10 e finisce a 932?
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


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Inserito il - 30 ottobre 2009 : 21:16:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
si è quello!
Ad esempio prendiamo la sequenza dell'mRNA del'alfa-actina umana:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001100.3

trovi scritto:

     gene            1..1509
               
     exon            1..93                 
                     /number=1
    
                    
     exon            94..234
                     /number=2

     CDS             106..1239
                     
     exon            235..559
                     /number=3

il gene va da 1 a 1509, di questa sequenza il primo esone va da 1 a 93, il secondo da 94 a 234...ecc...
però ti dice chela regione codificante è da 106 a 1239, quindi il primo esone e parte del secondo sono in realtà la 5'UTR il "vero" primo esone inizierà all'interno dell'esone 2.
In ogni caso sono segnate dove ci sono le giunzioni, quindi:

     exon            94..234
                     /number=2

     exon            235..559
                     /number=3

in mezzo tra 234 e 235 c'era l'introne!
Spero sia tutto chiaro ora.

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daruma
Nuovo Arrivato

Città: Stuttgart


12 Messaggi

Inserito il - 02 novembre 2009 : 13:58:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di daruma Invia a daruma un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Carissima,

sei stata di grandissimo aiuto. ti ringrazio di cuore dell'aiuto! se non ti disturbo troppo, tornero' a chiederti qualche consiglio, che ne pensi? grazie ancora e a presto, DARIO
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 02 novembre 2009 : 14:33:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh certo il forum è fatto per questo!
Chiedi pure quando hai bisogno!

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daruma
Nuovo Arrivato

Città: Stuttgart


12 Messaggi

Inserito il - 02 novembre 2009 : 18:57:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di daruma Invia a daruma un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ok contaci! ;) a presto, DARIO
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