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amelietta
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21 Messaggi

Inserito il - 29 ottobre 2009 : 18:43:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di amelietta Invia a amelietta un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti, solo ora mi sto avvicinando al fascinoso mondo dell'espressione genica e ho un dubbio (non solo uno in realtà!) riguardo l'estrazione dell'RNA. Lo scopo è poi andare a studiare l'espressione dell'mRNA della "mia" proteina (e dunque fare una quantitativa). Guardando vari kit di varie marche ho visto che si può estrarre direttamente il messaggero senza estrarre prima il totale. Nel mio caso credo sia meglio estrarre direttamente il messaggero ma...non so, qualcuno mi sa dare un consiglio? la resa del messaggero è forse superiore se estraggo prima il totale?
grazie grazie
ciao

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 29 ottobre 2009 : 21:54:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh ti solito basta estrarre l'RNA totale e da questo poi non c'è bisogno di purificare ulteriormente per avere solo l'mRNA. Se poi retrotrascrivi con oligodT comunque il tuo cDNA sarà fatto solo da mRNA messaggero. Ma in ogni caso anche se utilizzi altri metodi di retrotrascrizione puoi analizzare comunque il tuo mRNA di interesse.
Credo che almeno il 90% delle persone utilizzi RNA totale, puoi anche fartene un'idea guardando i lavori in letteratura, raramente o quasi mai ho visto scritto che hanno isolato solo l'mRNA. E anche io personalmente ho fatto un sacco di PCR quantitative partendo da RNA totale.

In ogni caso non credo che ci sia molta differenza di resa se estrai direttamente mRNA o se estrai prima l'RNA totale e poi isoli l'mRNA.
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amelietta
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21 Messaggi

Inserito il - 30 ottobre 2009 : 14:53:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di amelietta Invia a amelietta un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao GFPina grazie,
approfitto ancora per chiederti delle altre cose,
per la quantitativa io vorrei fare una relativa perchè mi interessa confrontare l'espressione tra gruppi di campioni diversi ma al momento posso fare solo un'assoluta, per la curva standard posso usare delle concentrazioni di DNA noto preparate da me? ho visto che quasi sempre si utilizzano plasmidi...per estrarre invece avrei scelto il kit della qiagen, che ne pensi?
ciao e ancora grazie
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Soshi Fujiwara
Nuovo Arrivato

Soshifujiwara



60 Messaggi

Inserito il - 30 ottobre 2009 : 16:08:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Soshi Fujiwara Invia a Soshi Fujiwara un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Provo a risponderti io che non sono un esperto.
Io l'ho visto fare con il DNA di Lambda diluito a diverse concentrazioni (lo comprai alla fermentas, ma credo che lo vendano anche altri) in modo da avere degli standard di fluorescenza.
Cmq dal confronto tra il metodo assoluto e quello relativo io mi sono sempre trovato meglio con l'uso di geni housekeeping. Mi sembra che i dati siano più consistenti..
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Franci81
Nuovo Arrivato



2 Messaggi

Inserito il - 30 ottobre 2009 : 17:12:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Franci81 Invia a Franci81 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao
ti do un'alternativa all'estrazione dell'RNA..

www.panomics.com
prodotto: QuantiGene 2.0

se ti interessa, fammi sapere!
buona serata
Francesca
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 30 ottobre 2009 : 19:08:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Riguardo l'estrazione il kit della Qiagen va benissimo, ce ne sono moltissimi di kit di estrazioni buoni, e quello della Qiagen è uno di quelli.

Per la quantificazione, il discorso è un po' più complesso...
innanzitutto cosa devi quantificare?
Se devi quantificare un gene espresso nei tuoi campioni trovo assolutamente scorretto fare una quantificazione assoluta utilizzando dei plasmidi con DNA o come dici tu addirittura del DNA a concentrazione nota, non avrebbe alcun senso!
Non puoi confrontare mele con arance! Se fai una quantificazione assoluta devi confrontare la stessa cosa!
Provo a spiegarmi per chiarirti le idee.
Riguardo alla quantificazione assoluta uno dei campi in cui è più utilizzata è quello in cui si vanno a vedere infezioni da virus utilizzi dei campioni in cui sono presenti delle quantità note di DNA virale e con questi ti costruisci una curva standard, poi utilizzando questa curva standard risali a quanto DNA virale c'è nei tuoi campioni ignoti.
Però se hai un DNA di "qualcosa" e vuoi utilizzarlo per quantificare "qualcos'altro" non ha molto senso (anche se a volte si vedo lavori fatti così).
Quello che puoi invece fare è una quantificazione relativa, oltre al tuo gene amplifichi anche un housekeeping che "deve" essere costante in tutti i tuoi campioni, cioè la sua espressione deve essere uguale in tutti i campioni e normalizzi rispetto a quello.
Nota che come ho detto altre volte (puoi cercare sul forum varie discussioni per "real-time" "quantificazione assoluta" "housekeeping"), ci sono delle cose da tenere in considerazione:
1° devi trovare l'housekeeping giusto: non è affatto detto che un housekeeping che è buono in alcune condizioni lo sia necessariamente sempre, ad es. Beta-Actina se fai un trattamento che va a modificare il citoscheletro Beta-Actina non è certo l'housekeeping migliore da scegliere. Devi assicurati prima di partire con la tua quantificazione che l'housekeeping scelto sia veramente housekeeping testandolo in tutti i tuoi campioni e assicurandoti che non vari.
Altra cosa che ho ripetuto svariate volte è che in realtà un solo housekeeping non basta! Bisognerebbe in realtà utilizzarne almeno 3 (alcune riviste, non tutte richiedono questo) e normalizzare uno rispetto agli altri per assicurasi che non variano. (se cerchi nelle discussioni vecchie ho linkato anche vari articoli in proposito).
Poi la maggior parte delle persone utilizza comunque un housekeeping solo, quindi non sarò di certo io a dirti che non devi farlo, ma almeno assicurati che sia stabile. Indubbiamente tra i più stabili ci sono gli RNA ribosomiali, quindi magari scegli uno di quelli.
2° per poter confrontare 2 geni diversi e utilizzare il metodo del -2deltadeltaCt devi assicurati che l'efficienza sia la stessa nelle 2 condizioni...

... beh in realtà a scrivere questa risposta ci ho messo quasi un ora, nel frattempo sto finendo i miei esperimenti in labo, e con le varie interruzioni sto perdendo anche il filo del discorso, quindi visto che sono cose che ho scritto sul forum svariate volte, magari ti linko delle discussioni dove abbiamo già parlato del problema e che ti possono essere utili:
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=13164
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=12875
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=7531

poi ci fossero altri dubbi chiedi!

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amelietta
Nuovo Arrivato



21 Messaggi

Inserito il - 31 ottobre 2009 : 13:21:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di amelietta Invia a amelietta un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciAO, grazie a tutti e in particolare a GFPina sei stata decisamente esauriente! ora mi guarderò con attenzione i link che mi hai indicato.
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