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Dionysos
Moderatore

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Città: Heidelberg


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Inserito il - 13 novembre 2009 : 00:16:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ok ragazzi, ammetto la mia totale incapacità
di far fronte a questo problema! :(

Mi ritrovo con due membrane Hybond trasferite da SDS-PAGE con
su campioni importantissimi, ma ahimé INSERVIBILI. E non so perchè!

Ho già eseguito con successo cinque diversi western su quelle
membrane, frammezzati da un evento di stripping (con protocollo
già validato, funziona bene e mai dato problemi). Attualmente le
membrane risultano più che positive al test del ponceau, ed il
marker colorato è ancora ben visibile. TUTTAVIA è assolutamente
impossibile farci sopra altri western, e non so perchè :/

Ho provato primari rabbit e primari mouse monoclonal, ciascuno
funzionava precedentemente su membrane identiche caricate con
campioni identici (l'esperimento in questione è un replicato...):
niente da fare signori, SEGNALE ZERO, nemmeno a un'esposizione di un'ora.

Ho cambiato:
- il latte, in effetti si sono beccate un secondario in latte semi-rancido, mea culpa (ahem...)
- il PBST, in effetti si sono beccate dei lavaggi in PBS senza tween, mea culpa (ahem...)
- il reattivo ECL, magari l'altro era esaurito, vallo a sapé
- la camera oscura!! : /

Non sono nemmeno disidratate, perchè quell'Hybond è "a prova di
disidratazione" (o così dice la Amersham) e un'intera notte in
PBST non le ha minimamente risollevate.

Solo s'intravede UN MINIMO di segnale all'esposizione di un solo
minuto, corrispondente a bande ben note (GAPDH) che comunque
non si trovano più se espongo per più di un minuto.

Ci tengo a sottolineare che fino a tre giorni fa, quel
segnale era fortissimo e ben evidente già a 10 secondi.
Che può essere capitato a 'ste membrane??

Suggerimenti/idee/consigli ? :(


Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!


GFPina
Moderatore

GFPina

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Inserito il - 13 novembre 2009 : 00:38:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos

Ho già eseguito con successo cinque diversi western su quelle
membrane...

non è che semplicemente stai chiedendo troppo a quelle povere membrane?

Citazione:
Solo s'intravede UN MINIMO di segnale all'esposizione di un solo
minuto, corrispondente a bande ben note (GAPDH) che comunque
non si trovano più se espongo per più di un minuto.

Ci tengo a sottolineare che fino a tre giorni fa, quel
segnale era fortissimo e ben evidente già a 10 secondi.

Beh questo mi sembra normale, la reazione chemioluminescente va in esaurimento, dopo un po' che la induci con l'ECL non funziona più!
Anzi a volte è talmente forte che puoi vedere una banda marroncina sulla membrana e una corrispettiva banda bianca sulla lastra.
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Dionysos
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D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 13 novembre 2009 : 00:43:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
non è che semplicemente stai chiedendo troppo a quelle povere membrane?


Nuuu questo dovrebbe essere ancora niente! :D
la sett scorsa ho fatto altri due western (ergo altre due coppie
di membrane) su cui ho incubato praticamente tutti gli anticorpi
di una pathway: in tutto 14 proteine tra fosforilate e non
...e son venute tutte, grazie a un paio di stripping e un po'
di "incastri" su pesi molecolari diversi e specie d'origine
diverse (alcuni primari erano murini, altri rabbit, altri human).

Anche queste, da brave, 'devono' sottostare a tali ritmi! : P

Citazione:
Beh questo mi sembra normale, la reazione chemioluminescente va in esaurimento, dopo un po' che la induci con l'ECL non funziona più!
Anzi a volte è talmente forte che puoi vedere una banda marroncina sulla membrana e una corrispettiva banda bianca sulla lastra.


eh sì, ma è normale che dopo UN minuto già decada?? : /
senza neanche avere avuto il tempo di manifestarsi

il kit ECL è nuovo, e ho espostoo in condizioni che
normalmente mi davano un segnale fortissimo...
c'è proprio qualcosa che non va : /

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Dionysos
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Inserito il - 13 novembre 2009 : 00:46:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
N.B . ah, OVVIAMENTE preparo ad ogni esposizione
una reazione ECL nuova, incubando la membrana
per un minuto, completamente immersa nel reattivo
(oppure ce lo gocciolo sopra, tenendola sul parafilm)

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GFPina
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GFPina

Città: Milano


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Inserito il - 13 novembre 2009 : 01:10:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
No aspetta una cosa mi sfugge!
Ma il segnale fortissimo che avevo di GAPDH è sempre sulla stessa membrana giusto?
Perché se è così quello che intendevo è che se ti dà un segnale forte la prima volta, poi la seconda volta che metti l'ECL c'è poco ancora con cui reagire e il segnale è più debole.
Tieni presente che è vero che l'ECL lo cambi ma l'anticorpo HRP coniugato è sempre quello, ovviamente parlando sempre della stessa banda!


Citazione:
Nuuu questo dovrebbe essere ancora niente! :D
la sett scorsa ho fatto altri due western (ergo altre due coppie
di membrane) su cui ho incubato praticamente tutti gli anticorpi
di una pathway: in tutto 14 proteine tra fosforilate e non

Comunque rimani uno "sfruttatore di membrane"!!!
Magari è solo ribellione!

Domanda: ma di cosa sono fatte le membrane?
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Dionysos
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Inserito il - 13 novembre 2009 : 01:12:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Domani guardo bene in lab, ma su due piedi direi PVDF!

(comunque ogni volta che voglio una banda reincubo con un
primario fresco, un secondario fresco e ECL fresco...tra
un giorno e l'altro tengo in PBST o/n per lavare via "il grosso"
degli Ab, al fine di poterci fare sopra altri western )

SI' si sono ribellate!! è una cosa INAUDITA

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domi84
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Smile3D

Città: Glasgow


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Inserito il - 13 novembre 2009 : 01:17:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Domanda (forse stupida): Può essere che sia andato qualcosa storto durante l'attivazione delle membrane, o durante il blotting...?
In tal caso non c'è niente (o poco) sulle membrane...quindi non vedi niente se non le proteine più espresse, no?!

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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GFPina
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GFPina

Città: Milano


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Inserito il - 13 novembre 2009 : 01:17:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Te lo chiedevo perchè Hybond ci sono sia di Nylon che nitrocellulosa che PVDF.
Nel caso fossero di PVDF puoi anche provare se non l'hai già fatto a riattivarle il metanolo, ma non garantisco che così si risolva il problema!

Però poverine, almeno evitagli il latte rancido!!!
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Dionysos
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Città: Heidelberg


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Inserito il - 13 novembre 2009 : 01:18:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Domanda (forse stupida): Può essere che sia andato qualcosa storto durante l'attivazione delle membrane, o durante il blotting...?
In tal caso non c'è niente (o poco) sulle membrane...quindi non vedi niente se non le proteine più espresse, no?!


Dubito, perchè il ponceau evidenzia un sacco di roba
e d'altronde ho già fatto 5 western su quelle stesse
membrane e son venuti tutti correttamente.

Tra l'altro uno di quelli era diretto contro VCAMI,
e pensa che sono cellule ematopoietiche del midollo osseo : /
(= la esprimono a quasi zero, ma è venuta pure bene)

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Dionysos
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Inserito il - 13 novembre 2009 : 01:20:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sì lo so il latte rancido è stato un colpo basso :P
(è che non so perchè mi è andato a male in pochi giorni)

Mi dicono che il latte rancido perossida gli anticorpi e le proteine:
sì, ok, ma così tanto da rendere inservibile una membrana "piena"?

boh.
Domani provo col metanolo (tanto ormai son disperato)

altre idee da aggiungersi ? :(

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Dionysos
Moderatore

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Inserito il - 13 novembre 2009 : 15:11:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Mi devo correggere: la Hybond che uso è di NITROCELLULOSA,
per cui niente da fare col metanolo....

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Dionysos
Moderatore

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Città: Heidelberg


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Inserito il - 14 novembre 2009 : 18:42:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
NESSUNO vuole prodigarsi ??? un consiglio qualsiasi!!

Non voglio buttare quelle membrane : (

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Dionysos
Moderatore

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Inserito il - 16 novembre 2009 : 16:19:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ok, il tecnico del mio lab dice che secondo lei è
colpa del latte vecchio di 7 giorni (e quindi un po' rancido).

In qualche modo deve aver rovinato i siti di legame delle
proteine rendendole inaccessibili agli anticorpi.

O esperti di western: vi risulta possibile una cosa del genere?

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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 16 novembre 2009 : 18:18:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
boh, io al max ho strippato una membrana 2 volte e già non era più il max...

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 16 novembre 2009 : 20:28:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non saprei, io non solo non ho mai sfruttato così le membrane, ma sopratutto non mi sono mai permessa di dargli latte rancido!
Che cambiamenti comporti di preciso non lo so, ma di sicuro bene non gli fa.
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Sepsi
Nuovo Arrivato



3 Messaggi

Inserito il - 19 novembre 2009 : 17:44:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Sepsi Invia a Sepsi un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Per quanto tempo lasci in incubazione la membrana con l'anticorpo primario? Io di solito quando prevedo segnali deboli incubo over-night a 4 gradi in agitazione.

Oppure prova con un primario piú concentrato (tipo 1:500).

Un altra idea potrebbe essere utilizzare l'ECL + plus (2 mL soluzione A, 50 uL soluzione B, ma se la membrana è piccola basta anche 1 mL A e 25 uL B) per almeno 5 minuti (spipettandoci sopra con delicatezza)

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marghe
Nuovo Arrivato

Prov.: Pisa
Città: volterra


2 Messaggi

Inserito il - 02 febbraio 2011 : 16:24:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di marghe Invia a marghe un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao, sono una nuova utente!!!! ho un problema molto simile al tuo con una membrana in PVDF: il segnale della tubulina lo vedo "verde" sul filtro ma al momento di sviluppare la membrana sparisce.
Hai mica risolto i tuoi problemi e capito da che cosa dipendeva?io ho cambiato soluz di sviluppo e fissaggio, lastre, ecl e sto impazzendo!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!grazie 1000
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Martin.diagnostica
Utente Attivo

H. pylori



1582 Messaggi

Inserito il - 02 febbraio 2011 : 16:39:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Martin.diagnostica Invia a Martin.diagnostica un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
io non capisco non fai prima a ripeterlo? cmq la prossima volta mettici un pò di NaN3 nel latte cosi eviti questi inconvenienti.
PS gia che ci sei ne prepari un pò di più e ti fai una bella zuppa, ho sentito dire che fà molto alle ossa
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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 02 febbraio 2011 : 16:47:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Ciao, sono una nuova utente!!!! ho un problema molto simile al tuo con una membrana in PVDF: il segnale della tubulina lo vedo "verde" sul filtro ma al momento di sviluppare la membrana sparisce.
Hai mica risolto i tuoi problemi e capito da che cosa dipendeva?io ho cambiato soluz di sviluppo e fissaggio, lastre, ecl e sto impazzendo!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!grazie 1000


Ciao marghe, il post è vecchio di quasi 2 anni per cui la faccenda oramai me lo sono lasciata
addietro. Il problema non sembrava essere il latte (perchè si è ripresentato pure bloccando in
BSA 5%) ma piuttosto sembra fosse dovuto ai residui di ECL che rimangono sulla membrana e
non solubilizzano bene nel PBST. Infatti lavando bene le membrane tutto torna a funzionare
correttamente. Non so se è il tuo problema, comunque in bocca al lupo.

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Daria85
Utente

aplisia



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Inserito il - 02 febbraio 2011 : 16:50:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Daria85 Invia a Daria85 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
in lab da me è successa la stessa cosa.
pensavamo fossero gli IG, ma poi abbiamo scoperto che semplicemente si erano scassati i lisati!
tu dove li conservi? a -20 o -80? conservi già delle aliquote preparati in TB?
noi abbiamo visto che tenendo i campioni in TB a -20 durano un po' del lisato semplice tenuto a -20, ma in entrambi i casi dopo qualche settima il WB da problemi.
la cs invece non accade se conservi a -80, ancora meglio se già in aliquote cn il TB.
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Daria85
Utente

aplisia



678 Messaggi

Inserito il - 02 febbraio 2011 : 16:51:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Daria85 Invia a Daria85 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
lol...ho visto ora ke il post era vecchio -.-...
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