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laviadellavirtu
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Inserito il - 15 novembre 2009 : 17:09:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di laviadellavirtu Invia a laviadellavirtu un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti sono nuovo...
ho 1 esame di ingegneria genetica la prossima settimana...
chiedo dunque aiuto alle persone piu' in gamba...
ecco il problema...
dobbiamo creare 3 versioni di proteina tronca...(una di 70 aa una di 84 e una di 106 aa)
il gene si trova clonato in un plasmide pbluescript II ks+(che produce dna a singolo filamento)
quindi kme mi insegnate kn i due promotori del fago il mcs vicino il 5'del gene gal(per il controllo) e l'origine di coli e del fago...
bene la per ottenere le proteine tronche verra' utilizzata una pcr kn primer moficati...mi fate capire come???
dopo aver ottenuto gli amplificati corretti verranno tagliati kn gli enzimi di restrizione corretti e clonati in un vettore di espressione tagliato kn gli stessi enzimi...e poi si trasformera' lievito per produrre le proteine create...
le domande sono:
quale è questa tecnica con i primer modificati???
come controllereste se gli amplificati sono corretti??
perchè utilizzare proprio questo vettore??
un saluto per tutti....

ps:in allegato trovate l'articolo originale...buona serata


Allegato: dddddd.txt
2,08 KB

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


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Inserito il - 15 novembre 2009 : 17:25:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
laviadellavirtu benveuto su MolecularLab!
Ho inserito l'allegato in questa discussione ed eliminato l'altra, e ho spostato la discussione in una Sezione più appropriata.
Se hai dimenticato qualcosa in una discussione non aprirne una nuova, ma continua nella precedente, altrimenti si genera confusione.

Scusa ma per quanto riguarda la tua sono di fretta ora e non ho neanche letto bene.
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laviadellavirtu
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51 Messaggi

Inserito il - 15 novembre 2009 : 17:27:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di laviadellavirtu Invia a laviadellavirtu un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
CHE DONNA FAVOLOSA...ti ringrazio...scusami ma devo capire bene come funziona il sito...
ma dve vai?? aiutami...
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 15 novembre 2009 : 20:28:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scusa ma non ho chiarissimo, tu devi capire cosa hanno fatto in questo articolo o devi disegnare una strategia per fare le proteine tronche?
Premetto che l'articolo non l'ho letto, quello che hai allegato tu è solo un pezzo di materiali e metodi, l'articolo comprelto comunque si trova qui:
Mcm4 C-terminal domain of MCM helicase prevents excessive formation of single-stranded DNA at stalled replication forks

Riguardo alle tue domande quello che ti posso dire, senza però aver letto l'articolo è:
Citazione:
quale è questa tecnica con i primer modificati???

Semplicemente una PCR solo che al posto di utilizzare primers complementari alla tua sequenza ne utilizzi uno che ha una mutazione, in questo modo nell'amplificato verrà introdotta quella mutazione.
Ad es. per la proteina da 70aa
Citazione:
The reverse primer (5#8242;-AACAGCTATGACCATG) was paired with the forward mutagenesis primer mcm4-cd70 [5#8242;-CGAGATCTTAGACCATATCTTCAGGTACCAAAG (the underlined portion represents the BglII site, and the italicized portion represents the stop codon that was introduced)],

Il primer reverse contiene questa mutazione TTA: 5'-CGAGATCTTAGACCATATCTTCAGGTACCAAAG
che verrà introdotta nell'amplificato, in quella posizione.
Questo verosimilmente genererà un codone di stop che darà origine ad una proteina tronca da 70aa.
Citazione:
come controllereste se gli amplificati sono corretti??

sequenziamento immagino

Citazione:
perchè utilizzare proprio questo vettore??

beh penso che se ne possano utilizzare anche altri
comunque queste sono le caratteristiche di quel vettore:
pBluescript II KS(+/-), pBluescript II SK(+/-)
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laviadellavirtu
Nuovo Arrivato



51 Messaggi

Inserito il - 15 novembre 2009 : 21:39:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di laviadellavirtu Invia a laviadellavirtu un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao gfpina ti ringrazio per la risposta....
perdonami ma nn ho chiare alcune cose...
il pbluescript prodice dna a singolo filamento quindi mi chiedevo...in questo vettore ci deve essere l'origine di replicazione del fago per produrre il dna a doppio filamente e poi iniziare la tecnica "pcr"...è giusto?
poi se gentilmente leggi l'allegato c'è scritto come controllano gli amplificati ma nn ho capito...avevi detto sequenziamento ma non mi pare...
poi dici che si preparano ad hoc quei primer che hanno "verosimilmente" dei codoni di stop...in effetti una tripletta con timina non genera uno stop quindi mi chiedevo come si fa a generare le 3 proteine tronche...
ti ringrazio per la collaborazione...

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 15 novembre 2009 : 23:15:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
il pbluescript prodice dna a singolo filamento quindi mi chiedevo...in questo vettore ci deve essere l'origine di replicazione del fago per produrre il dna a doppio filamente e poi iniziare la tecnica "pcr"...è giusto?

Il vettore in sé è a doppio filamento, come si capisce anche dal link che ti ho segnalato, non c'è bisogno di produrre nessun DNA per fare la PCR ma si prende il vettore con l'inserto (che è il pTN529 derivato dal pBluescript II KS+) e lo si utilizza come stampo per la PCR.

Citazione:
poi se gentilmente leggi l'allegato c'è scritto come controllano gli amplificati ma nn ho capito...avevi detto sequenziamento ma non mi pare...

l'allegato che hai linkato tu, che sono i materiali e metodi dell'articolo l'ho letto, dice:
Citazione:
The PCR products were digested with XhoI and BglII, and the resulting 1.1-kb XhoI-BglII fragments were introduced into the XhoI and BglII sites of pTN529 to create pTN565, pTN558, and pTN559, respectively. The absence of any additional mutations in the PCR fragment was confirmed by DNA sequencing.

Quindi gli amplificati sono stati clonati nel vettore e poi controllati mediante sequenziamento.

Citazione:
poi dici che si preparano ad hoc quei primer che hanno "verosimilmente" dei codoni di stop...in effetti una tripletta con timina non genera uno stop quindi mi chiedevo come si fa a generare le 3 proteine tronche...poi dici che si preparano ad hoc quei primer che hanno "verosimilmente" dei codoni di stop...in effetti una tripletta con timina non genera uno stop quindi mi chiedevo come si fa a generare le 3 proteine tronche...

Non è una tripletta con timina!
Scusa prima avevo dimenticato di sottolineare una base (adesso ho corretto), la sequenza mutata non è solo TT ma TTA, in ogni caso anche se la A fosse stata presente nello stampo originale e non solo nel primer mutato la cosa non cambia.
Hai TTA nel primer "reverse", questo vuol dire che nella sequenza amplificata, che è invertita e complementare rispetto al primer reverse avrai: TAA (codone di stop ocra)
quindi genera una proteina tronca!
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laviadellavirtu
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51 Messaggi

Inserito il - 15 novembre 2009 : 23:39:45  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di laviadellavirtu Invia a laviadellavirtu un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ottima risposta...ti ringrazio...buona serata
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