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pesciolino
Nuovo Arrivato



11 Messaggi
Inserito il - 30 novembre 2009 : 10:33:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di pesciolino Invia a pesciolino un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti....ho un pò di problemi con quet'articolo ....esso tratta dell'espressione della miostatina.Dopo aver eseguito la rt pcr si procede con il southern blot. l'ibridazione avviene in presenza di una sonda marcata con digoxigenina sintetizzata attraverso la pcr utilzzando gli stessi primers dell'rt pcr ed un plasmide contenente la completa miostatina cdna come stampo.potreste spiegarmi questo concetto???? la sonda come viene sintetizzata attraverso la pcr e perchè si utiliza il plasmide????
grazie a tutti.

Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi
Inserito il - 30 novembre 2009 : 13:18:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Attento, se studi espressione genica tramite RT-PCR
quello che farai sarà un Northern blot (non un southern)

Il plasmide col cDNA si usa come stampo per sintetizzare una
sonda che sia esattamente complementare al trascritto maturo
(spliceato) del gene in questione.

Secondo me "con gli stessi primers della RT-PCR" significa
semplicemente che si utilizzano nonameri/esameri random. Ti risulta?
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi
Inserito il - 30 novembre 2009 : 13:53:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
No è un Southern, perchè quello che blotti sulla membrana è di fatto DNA (amplificato dalla PCR) non l'RNA di partenza.
Anche se è vero che il tutto ti serve per analizzare l'RNA.

"gli stessi primers della RT-PCR" sono i primers che usi per la PCR dopo la retrotrascizione, quindi non random examers ma i primer specifici per il tuo templato.
Per come si fa la sonda prova a guardare ad es. questo, è la spiegazione di un kit: PCR DIG Probe Synthesis Kit From Roche
poi bisogna vedere nell'articolo esattamente cosa abbiano fatto, ma il senso è quello.
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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi
Inserito il - 30 novembre 2009 : 17:16:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ops è vero
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

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pesciolino
Nuovo Arrivato



11 Messaggi
Inserito il - 01 dicembre 2009 : 09:01:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di pesciolino Invia a pesciolino un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
è necessariamente un southern
quello che non capisco è perchè si utilizza un vettore di clonaggio come stampo???? è necessario???
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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Barcellona


1912 Messaggi
Inserito il - 01 dicembre 2009 : 10:21:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
il cDNA da stampo all interno del plasmide ti serve unicamente per sintetizzare la sonda,non per il resto del southern

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pesciolino
Nuovo Arrivato



11 Messaggi
Inserito il - 01 dicembre 2009 : 10:57:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di pesciolino Invia a pesciolino un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie grazie grazie!
avrei erò un'altra domanda...non ho capito perchè dopo la RT PCR si esegue la rapid amplification of cdna ends (5'RACE). perchè viene sviluppata e come funziona questa tecnica?
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