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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
 Inserito il - 05 dicembre 2009 : 09:51:37
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Salve a tutti!
Avrei bisogno di mettere a punto una trasfezione su una linea cellulare primaria, in particolare i MEFs: fibroblasti embrionali murini.
Nel mio lab mi hanoo detto ke sono particolarmente resistenti alla trasfezione.
Voi avete qualche protocollo?
Oppure potete dirmi da dove iniziare?
Ovviemente volevo fare + prove con diversi metodi, in modo da avere + probabilità di successo :P ...
In lab ho a disposizione il sistema di trasfezione basato sulla lipofectamina, ke uso spesso per trasfettare hek293.
Volevo testare anche qsto sui mefs: avete qualke accortezza da consigliarmi?
Inoltre qualsiasi consiglio o segnalazione di un metodo che secondo voi è + adatto o fonte di informazione.. è ben accetto!
Grazie fin da ora!
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Ascoltami con gli occhi... |
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nomis
Nuovo Arrivato
Città: roma
16 Messaggi |
Inserito il - 15 dicembre 2009 : 17:22:46
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scusami ho letto solo adesso...
dunque i MEF sono molto meglio degli umani HF se ti può rincuorare...
io li trasfetto con lipofectamine plus seguendo il normale protocollo... invece nelle mie mani la lipo 2000 mi crea più tossicità anche se è usata ugualmente..
ti consiglio però di provare a fare una curva di tossicità anche con la lipo 2000 cambiando i rapporti tra DNA e Reagent... ne troverai sicuramente l'optimum (soprattutto se quello che devi trasfettare non è ben tollerato dalle cellule in generale) |
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mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato
116 Messaggi |
Inserito il - 16 dicembre 2009 : 17:25:42
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| per esperienza so che il FuGene è molto potente. |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 22 dicembre 2009 : 18:57:16
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Scusatemi ma anche io ho letto solo adesso le vostre risp. 
nomis: certo che mi hai rincuorato!!! Anche se nn so cosa siano gli HF umani. 
Nel frattempo... ho fatto qualke prova con l'unica cosa che ho a disposizione: lipofectamina 2000.
Ho fatto prove facendo:
- trasfezione "tutto in optimem" (le mix in optimem e mettendo optimem alle cellule, anzichè terreno, durante le ore in cui ho lasciato il mezzo di trasfezione a contatto con le cell).
- trasfezione "tutto in terreno" (le mix fatte in terreno.
- mettendo meno lipo e lipo da protocollo.
- le quantità di DNA le ho lasciate sempre come qlle da protocollo.
E nn l'ho fatto per un preciso motivo: volevo trovare un metodo "standard" che andasse bene per ottimizzare POI le quantità dei diversi DNA che vorrei trasfettare, eheh.
I risultati di tutto ciò son stati ke le cellule stavano bene in tutti i casi (la lipo nel mio caso nn sembra essere stata tossica) ed ho ottenuto qualke cell trasfett (nn ho contato, ma diciamo un 5%) solo facendo tutto in terreno e con le stesse quantità di lipo del protocollo.
Ovviamente, devo aumentare l'effic di trasfezione!!!
In tutte le prove fatte ho piastrato le cell come da protocollo (confluenza del 90%), ma dal momento ke ho letto in letteratura che le piastrano anche a confluenza minore per trasfett (60%) pensavo di fare un'altra prova piastrandole al 60% di confl.
Avete qualke idea migliore? Qualke altro consiglio?
Nomis, tu quante ne piastri per vedere lespressione a 24h dalla trasfez? e per vederla a 48h?
Quanto tempo lasci il mezzo di trasfezione prima di cambiare il terreno?
Grazie del supporto! 
P.S. avevo letto anche io del fugene, ma dal momento ke nn l'ho a disposizione e dovrei comprarlo (e nn è economico...), volevo cercare di risolvere facendo con la lipo, visto ke in letterat lo fanno. Grazie cmq del consiglio! |
Ascoltami con gli occhi... |
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mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato
116 Messaggi |
Inserito il - 14 gennaio 2010 : 11:19:58
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| Se chiedi dovrebbero darti un piccolo campione di prova per il FuGene |
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Didattica e Relazioni
