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 Biologia Molecolare
 affascinante problema di transfezione
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d.goldy
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39 Messaggi

Inserito il - 06 dicembre 2009 : 21:35:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di d.goldy Invia a d.goldy un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti, per fortuna che esiste questo forum, l'inventore è un genio!
Ora passo al mio problema:
Sto stransfettando non stabilmente HL-1 che è una linea cellulare di cardiaca, le cells sono miociti e sono un po' difficili da transfettare. Ovviamente uso lipofectamine 2000 di invitrogen e ho ottimizzato le varie concentrazioni di DNA plasmidico e regente. Il problema è che l'efficienza che ho avuto è del 50% circa, magari anche meno... non riesco ad avere più di così! potrei provare ancora ma poi usereu tutta la costosissima lipofectamina per l'ottimizzazione.
Allora, visto che non mi servono troppe cellule, ho pensato di eliminare le non trasformate con g418 perchè il plasmide ha neoR... non sono riuscita però a trovare nessun articolo che usasse questo metodo, le uniche notizie che ho trovato riguardano trasfezioni stabili a cui non sono interessata, ma che consigliano da 200 a 1000mg/l di G418.
Le mie domande sono 2
1) qualcuno ha mai fatto qualcosa del genere?
2) Ho testato le cell con concentrazioni crescenti di g418 che usano per le trasfezioni stabili anche se viene conigliato di contarle almeno al terzo giorno (se ho capito bene). il mio problema è che mi servono le cells dopo 2 giorni da trasfezione e non posso aspettare di più e al terzo giorno ho ancora troppe cells, inotre non ho una corrispondenza diretta tra concentrazione di antibiotico e morte cellulare, infatti muoiono più cells con 400mg/l che con 800 e 1000....strano vero?
Ora mi chiedo se la mia teoria è applicabile, e visto che le cells mi servono dopo 2 giorni e non 3 o più, posso usare una concentrazione maggiore di g418 o vado incontro a modificazioni strane?
Spero che qualcuno là fuori mi possa aiutare perchè il mio capo non ne sa un cavolo di trasfezioni... e nemmeno i colleghi, please Help

Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 06 dicembre 2009 : 21:45:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
E' assolutamente normale che tu abbia bisogno di una transfezione
stabile per isolare cellule resistenti, questo perchè il tempo necessario
per ottenere la morte completa delle cellule non resistenti (risparmiando
quelle resistenti, ricordando che subiscono comunque uno shock tossico)
è in ogni caso superiore al tempo durante il quale il DNA plasmidico
transfettato rimane all'interno del nucleo di una linea cellulare, prima
di venire diluito per divisione cellulare o degradato durante essa.

Io ho tentato a fare quello che fai tu, cioè un enrichment di
cellule transfettate, utilizzando la Zeocina (molto più rapida
del G418 nell'eliminazione delle non resistenti) ma c'è ben
poco da fare: nei giorni immediatamente successivi all'aggiunta
dell'antibiotico, le cellule subiscono uno shock generalizzato
e non puoi certo sottoporle ad analisi biochimiche attendibili.

La tua necessità di raccogliere a due giorni è, poi, del tutto
incompatibile con i vettori virali. L'unica scelta possibile è
purtroppo la transfezione: ti consiglierei di valutare altri
sistemi per aumentare l'efficienza, quali l'elettroporazione
o il calcio fosfato. Ogni linea ha le sue "preferenze".

In bocca al lupo

Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!


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d.goldy
Nuovo Arrivato



39 Messaggi

Inserito il - 07 dicembre 2009 : 01:14:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di d.goldy Invia a d.goldy un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao Dionysos, Grazie per la tua risposta
dimmi se ho capito bene, l'unico modo per avere più cellule trasfettate che non trasfettate è di trovare un sistema che mi dia un efficienza maggiore e non è possibile eliminare le cells non trasfettate in nessun modo? io devo estrarre miRNA dalle cells trasfettate (poichè il vettore porta il miRNA)e paragonarle ad un controllo negativo trasfettato anch'esso, se ci sono troppe non trasfettate la differenza è troppo piccola e dovrei aumentare N per avere qualcosa di decente... ma costa troppo!
secondo te il calcio fostato funziona meglio dei lipidi cationici? e secondo te aumentare la concentrazione di FBS nel medium potrebbe aiutare?
Non so più cosa pensare...
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RM
Nuovo Arrivato



115 Messaggi

Inserito il - 07 dicembre 2009 : 12:40:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di RM Invia a RM un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao
Una percentuale del 50% non è poi così bassa, se il tuo scopo è l'espressione genica. Comunque io ho avuto degli ottimi risultati con le hl-1 usando il fugene HD. Magari puoi provare
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d.goldy
Nuovo Arrivato



39 Messaggi

Inserito il - 07 dicembre 2009 : 12:46:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di d.goldy Invia a d.goldy un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao!!!
Che efficienza hai avuto con fugene? e non é che mi manderesti il protocollo e qualche suggerimento? Please????
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RM
Nuovo Arrivato



115 Messaggi

Inserito il - 07 dicembre 2009 : 13:13:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di RM Invia a RM un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Con il fugene era circa il 60-70 %. (Valutata ad occhio come percentuale di cellule GFP-positive). Comunque cerco i protocolli e appena posso ti mando un pm
Ciao
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d.goldy
Nuovo Arrivato



39 Messaggi

Inserito il - 07 dicembre 2009 : 13:53:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di d.goldy Invia a d.goldy un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
WONDERFUL!!! GRAZIE MILLE! ASPETTO CON FIDUCIA :)
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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 10 dicembre 2009 : 09:47:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il Fugene funziona molto bene nelle linee, ma non si può
dire a priori: io l'ho usato su Hela e COS, ma quelle cellule
non le ho mai usate. Credo comunque che un'efficienza come
quella riportata da RM sia assolutamente realizzabile. Prova.

Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!


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RM
Nuovo Arrivato



115 Messaggi

Inserito il - 10 dicembre 2009 : 18:50:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di RM Invia a RM un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ti ho mandato un pm
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d.goldy
Nuovo Arrivato



39 Messaggi

Inserito il - 11 dicembre 2009 : 14:31:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di d.goldy Invia a d.goldy un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie ragazzi, siete stati molto carini!
Ora il mio compito è chiedere al capo se mi compra il fugene... dopo la lipofectamina ci sarà da ridere :)
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 11 dicembre 2009 : 15:29:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh prova a contattare un rappresentante Roche e vedi se riesci a farti far dare un campione di prova!
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nomis
Nuovo Arrivato

0613_da_Fil23

Città: roma


16 Messaggi

Inserito il - 15 dicembre 2009 : 17:08:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di nomis Invia a nomis un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
leggendo i vostri post volevo aggiungere qualcosa.. innanzi tutto anche 3 giorni di selezione con neo sono pochi. ti ricordo che per stabilire la dose di selezione dovresti fare una curva con conc diverse e dovresti identificare la più bassa dose di antibiotico che uccide le cellule non trasfettate in circa 7 giorni (la puromicina per esempio si calcola in circa 5 giorni).
quindi il sistema stabile così fatto non è per te ottimale... quello che ti risolverebbe il problema potrebbe essere un sitema inducibile stabile cioè delle cellule trasfettate stabilmente in cui però "accendi" o "spegni" l'espressione in questo caso del miR per il tempo che ti serve (cioè 48 ore come dici tu)
ma è solo un'idea... che ovviamente comporta la costruzione (o il doverlo comprare esistono già fatti così ) di un altro vettore... certamente prima proverei altri metodi di trasfezione
in bocca al lupo
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d.goldy
Nuovo Arrivato



39 Messaggi

Inserito il - 16 dicembre 2009 : 01:06:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di d.goldy Invia a d.goldy un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao Nomis, Grazie per il consiglio!!!
Io uso un plasmide che non è inducibile... che ne sappia io... Dio come sono ignorante!
Il vettore che stiamo usando è già stato usato per 3 miR e non ho voglia di clonarli con un altro vettore perchè nella prima parte della mia ricerca ho già usato questo ed non credo sia indicato cambiarlo.
Comunque, per quanto riguarda i giorni di trasfezione, per quel che so di solito si considerano 2 giorni, al massimo 3 poi rischi che le cells perdano il plasmide...è così?
Abbiamo pensato alla trasfezione stabile, ma anche quella non so quanto convenga visto che io userò le cells principalmente per il patch clamping (non ne servono molte) e poi se riesco a trovare un modo per avere una transfezione decente per estrarre l'RNa e vedere se c'è downregulation dell'mRNA (cosa che dubito), ma questo è secondario. Ho uno studente per la triennale che ha un progetto di 1 anno e avevamo pensato di dargli da fare una piccola variazione della mia ricerca e fargli trasfettare le cells col miR ed estrarre RNA del mio gene di interesse.

Scusate se sono un po' prolissa, ma mi piacerebbe sapere cosa pensate di quel che ho fatto fin'ora:
Ho provato la curva di "morte" con diverse concentrazioni di antibiotico, ma come hai detto anche tu dopo 4 giorni non erano morte poi tante cells (le ho solo guardate al microscopio e fatto delle foto).
Allora ho riprovato con le cells trasfettate, ma testando solo 2 delle concetrazioni più alte ed effettivamente abbiamo visto che al secondo giorno sono morte moltissime cells, ma ancora non so dire se selettivamente o no... Con la lipofectamina posso aggiungere l'antibiotico dopo 4 ore perchè se no sarebbe tossico. Pare però che lo sia comunque visto che le cells muoiono di più, però, devo dire che questo mi fa ben sperare perchè se fosse un po'più tossico per le cells non transfettate, anche se rimango con poche cells alla fine posso cmq estrarre l'RNA... Secondo voi è un approccio poco scientifico?
Granzie ancora un sacco per i vostri consigli... senza di voi in lab mi sento così sola e abbandonata!
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Biologist1983
Nuovo Arrivato



2 Messaggi

Inserito il - 27 marzo 2012 : 13:58:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Biologist1983 Invia a Biologist1983 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti, sto cercando di trasfettare stabilmente con un shRNA delle cellule pancreatiche murine le beta TC6. Usando un plasmide con GFP fornitomi dalla Lonza le cellule presentano un'alta percentuale di trasfezione ma usando come controllo il mio plasmide di interesse senza shRNA ma con GFP ottengo si e no 1 cellula su un milione e mezzo. La trasfezione la sto facendo con la amaxa della lonza (ho provato anche la lipofectamina e il risultato era uguale ora ci riprovo di nuovo). Avete qualche bel suggerimento? grazie a tutti e buon lavoro
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