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robodont
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Inserito il - 11 gennaio 2010 : 12:02:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di robodont Invia a robodont un Messaggio Privato
Innanzi tutto un saluto a tutti i partecipanti del forum ed agli amministratori.
Spero inoltre possiate giustificare fin da subito la mia ignoranza in merito a quanto sto per chiedervi.
Io non sono di estrazione biologica o di laboratorio e quindi le mie conoscenze sono molto scarse sopratutto in merito alle tecniche.
Sono di estrazione medica e principalmente chirurgica. Pratico come odontoiatra ed ultimamente sono rimasto colpito da un lavoro clinico messo a punto da alcuni otorini del centro italia. Ora mi spiego: esistono delle tecniche che permettono di far crescere in coltura cellulare cellule epiteliali al fine di innestarle sul corpo ricevente come per esempio nei grandi ustionati. Il mio interesse è rivolto nello specifico alla possibilità di utilizzare colture di cellule epiteliali gengivali al fine di sopperire alle carenze anatomiche che si creano spesso in chirurgia.
Ora, di siti donatori ne ho quanti ne voglio. La tecnica di sutura e di posizionamento della coltura la conosco e non è un problema. MI MANCA LA PARTE IN MEZZO

Mi sapreste dare una mano come a percorrere il suo primo pezzo di strada sconosciuta ad un cieco?

La mia unica esperienza di laboratorio è stata la mia tesi di laurea nel campo della fisiologia con micropipette di vetro e rilevazioni pressorie su gengive (in vivo) di coniglio... oltre il buio.

Quindi, tornando a bomba. Faccio un prelievo.... e poi? Con che tecnica isolo le cellule mucose? rischio di avere una brodaglia di cellulae tra cui anche connettivo e sierose? E poi quale è il corretto terreno di coltura?

Vi prego cercate di capire il mio interesse e non snobbatemi sui due piedi per favore. Nella mia esperienza ho imparato più da forum che non dai testi e dall'università dove pare che la conoscenza la vogliano tenere per loro..

Grazie mille ed ancora tanto piacere di essere qui in questo forum miracolosamente apparsomi oggi!

ukitel
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Inserito il - 11 gennaio 2010 : 12:15:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ukitel Invia a ukitel un Messaggio Privato
Ecco... chiedere la collaborazione fattiva di biologi/biotecnologi?
Loro sanno sicuramente cosa fare, e possono farlo sicuramente meglio di te, se hanno studiato bene :D
Non perché tu non ne sappia nulla, ma perché è un lavoro diverso dal tuo.

Inoltre non vorrei scoraggiarti, ma spero tu non stia parlando di test sull'uomo, perché in tal caso dovresti aderire a procedure burocratiche, etiche, di sicurezza, di controllo qualità e trials clinici che manco conosco...

Il tuo problema non è affatto semplice. Qualcosa a riguardo la so, ma giusto da qualche esame universitario, non per esperienza personale.
Provo a farti un elenco...

Innanzitutto... La carenza è limitata al solo tessuto epiteliale? O coinvolge anche altri tipi di cellule, tipo quelle del connettivo sottostante? Perché già se sono 2 tipi cellulari organizzati tra loro al momento mi pare che non se siamo capaci...

Il tessuto com'è organizzato? Perché a parte un monolayer di cellule, non siamo capaci di riprodurre alcuna organizzazione tissutale.

Le cellule epiteliali crescono su supporto, poco ma sicuro: devi sapere come attaccarle e come farle staccare senza stracciare il sottile strato di cellule.

Devi sapere che cellule isolare... Perché non tutte le cellule crescono. Devi sapere ancora una volta com'è organizzato il tessuto, dove sono le staminali e recuperare quelle...

Poi devi sapere come farle crescere, ecc...
Mi fermo qua, perché mi accorgo che potrei continuare per molto ancora. Insomma, hai bisogno di qualcuno che con queste cose lavori, perché richiedono troppe conoscenze che un medico italiano non ha.

Comunque l'idea è molto molto interessante e ti auguro fortuna nel realizzarla.
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robodont
Nuovo Arrivato



12 Messaggi

Inserito il - 11 gennaio 2010 : 12:34:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di robodont Invia a robodont un Messaggio Privato
posso inserire alcune immagini tratte dal libro degli autori di cui ho parlato sopra in merito alla protezione dell'inesto.
A livello istologico posso certificare che si tratta di epitelio mucoso gengivale fatto per l'appunto come tu dici da un monolayer (direi fino a 4 cellule stratificate una sull'altra)

Non escludo l'aiuto di un biologo ma capisci che devo trovare un biologo coi controfiocchi a livello empatico che sappia capire cosa cerco, che non metta d'innanzi i soldi, che sia autosostenibile per sperimentare cose che probabilmente esulano dal suo campo specifico... e questo mi sembra già una cosa insormontabile....
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ukitel
Nuovo Arrivato



78 Messaggi

Inserito il - 11 gennaio 2010 : 12:48:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ukitel Invia a ukitel un Messaggio Privato
E puoi certificare che la carenza di questi tizi sia ristretta al solo epitelio mucoso gengivale e non anche al tessuto connettivo?
Pensi che in quelle carenze il solo epitelio gengivale possa sopperire a quella carenza?
Hai idea di come far integrare il tessuto innestato con quello precedente?
Hai almeno idea di come funziona l'innesto di pelle?

Scusami, ma il problema è che sei tu che stai esulando dal tuo campo specifico, lo testimonia il fatto che non sai da dove iniziare.

Ovviamente c'è fior fiore di biologi che si occupano di quell'argomento, e di biologi che potrebbero dedicarsi all'argomento molto più facilmente di quanto possa fare tu.
E non ti preoccupare che chi fa ricerca, è proprio costretto a pensare poco o per niente ai soldi... Con quello che ci pagano -_-'
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robodont
Nuovo Arrivato



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Inserito il - 11 gennaio 2010 : 13:04:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di robodont Invia a robodont un Messaggio Privato
La carenza invero è di tutto l'epitelio nel suo spessore mettiamo, a livello gengivale, periosto-connettivo-basale-epitelio-cheratina.
In casi di ampia zona scheletrizzata (qui parlo dei mascellari nella loro zona alveolare dove ci sono i denti più o meno estratti) si può:
1 non fare nulla e lasciar guarire per seconda intenzione
2 fare un lembo a scivolamento a coprire la zona interessata
3 fare un innesto di gengiva prelevato per esempio dal palato
4 la proposta di cui sopra di cui, prometto, vi mando le referenze

Se fai i lembi di scivolamento (quelli che in genere uso io) perdi la forma anatomica precedente che potrebbe essere importante a fini protesici e spesso la gengiva che si forma non è cheratinizzata.
Il lembo a prelievo dal palato cmq è un raddoppiamento del disagio chirurgico.
La guarigione per seconda intenzione a volte non è possibile se la zona esposta è esagerata.
La tecnica 4 invece sarebbe ottimale perchè con un prelievo ridotto alla persona poi permette di coprire l'area operata...

Poi è vero che esuli dal mio campo perchè mi piacerebbe mettereci mani direttamente nella procedura.

Ma appunto non potresti suggerirmi quali sono i terreni come si arriva alla posa sul terreno dal prelievo che ho in mano?

Mettiamo anche che (come è probabile) io non ci possa fare niente per lo meno ho imparato qualcosa in più no?
Non fa mica male la conoscenza? o sbaglio?
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ukitel
Nuovo Arrivato



78 Messaggi

Inserito il - 11 gennaio 2010 : 15:32:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ukitel Invia a ukitel un Messaggio Privato
Scusami, ma sembra che tu non ti renda conto della complessità di quello che chiedi, nonché di spiegare a una persona, che ammette di non saperne nulla, qualcosa che richiede invece un background molto sostanzioso.

Ci provo lo stesso, per quanto possibile :S, nelle mie modeste capacità didattiche.

Dopo disinfezione e disaggregazione delle cellule...

Immagino che i cheratinociti gengivali abbiano un modo di crescere simile a quello di quelli epidermici... Semplificando direi che ha 2 soluzioni:
- Fai crescere i cheratinociti in DMEM su feeder layer di cellule 3T3 J2 irradiate, che è stato il metodo utilizzato da Green e che ha aperto la strada ai trapianti di pelle.
- Fai crescere in keratinocyte basal medium supplementato con insulina, idrocortisone, hEGF e estratto di ipofisi bovina... e ovviamente senza siero. Ma dovresti poterlo trovare già fatto.

Prendiamo l'ultimo caso, perché è più semplice e non hai il problema dei fibroblasti.
Tripsinizzi e cambi mezzo ogni 2 giorni, fino a quando non raggiungi la quantità giusta, li fai crescere nel mezzo di prima con cloruro di calcio per attivare le caderine, e farle differenziare.

Ovviamente controlli e ricontrolli la coltura e la contaminazione ogni giorno ed elimini tutte le parti infette.

Questo è il metodo più semplice per ottenere un fac-simile di un tessuto cheratinocitico umano... fonte: "Epithelial Cell Culture Protocols" vol 188 dei Methods in Molecular Biology, editore Humana Press.
Il layer così fatto non è possibile impiegarlo per i trapianti su uomo. Credo che, al massimo, è utilizzabile per quelli su topo e si procede così:

Ottenuto il foglio lo fai staccare dalla piastra con dispase.
Lo isoli e lo fai aderire a una membrana di collagene.

Dopodiché lo congeli e lo trasporti.
Scongeli a 37°C e metti in DMEM al 10% di FCS in sala operatoria.
Poi il resto non è arte mia XD
Ti posso solo dire che almeno per il trapianto di pelle non si sutura niente, ma si benda solo: la pelle aderisce da sé.

Questi sono i passaggi principali, e penso sia facile immaginare che come per un'operazione chirugica o una procedura ortodontica ogni passaggio richiede ulteriore approfondimento, strumenti e conoscenze che qui non c'è modo di spiegare tutte.
Tuttaiva non credo che la metodica su uomo differisca molto, sono solo presenti numerose restrizioni e standardizzazioni a cui aderire fedelmente per garantire la sicurezza della metodica... Forse viene utilizzato il metodo di Green che essendo più "vecchio" è più conosciuto e più testato... Ma su questo non posso aiutarti.
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robodont
Nuovo Arrivato



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Inserito il - 11 gennaio 2010 : 16:21:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di robodont Invia a robodont un Messaggio Privato
Comincio a capire la difficoltà ma non mi arrendo tanto facilmente!
La procedura indicata dagli autori citati da me nel primo post è fatta con la prima metodica (Fai crescere i cheratinociti in DMEM su feeder layer di cellule 3T3 J2 irradiate, che è stato il metodo utilizzato da Green e che ha aperto la strada ai trapianti di pelle)

Quando dici che è possibile trovare il substrato già fatto ti riferivi al secondo?
(Fai crescere in keratinocyte basal medium supplementato con insulina, idrocortisone, hEGF e estratto di ipofisi bovina... e ovviamente senza siero. Ma dovresti poterlo trovare già fatto.)

Ti ringrazio per la referenza allegatami e nel prossimo messaggio allego 3 foto
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ukitel
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78 Messaggi

Inserito il - 11 gennaio 2010 : 16:29:45  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ukitel Invia a ukitel un Messaggio Privato
Sì, cmq significa che trovi il keratinocyte growth medium che è già pronto da usare sulle cellule, niente feeder-layer.
E' infinitamente più pratico ma il suo costo è ovviamente più alto, inoltre credo che sia "research only".
Sicuramente per i trapianti di pelle è stato utilizzato il metodo di Green, non so oggi.
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robodont
Nuovo Arrivato



12 Messaggi

Inserito il - 11 gennaio 2010 : 16:29:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di robodont Invia a robodont un Messaggio Privato
Per rispondere iconograficamente ad alcune domande fatte precedentemente allego la foto del layer cellulare applicato in situ, della sua istologia della sua protezione sul sito donatore e del risultato clinico.
In questo caso sono serviti 20 giorni per la preparazione della layer colturale.

grazie degli aiuti

Immagine:

1023,61 KB

Immagine:

1050,81 KB

Immagine:

1001,51 KB

Immagine:

980,04 KB
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robodont
Nuovo Arrivato



12 Messaggi

Inserito il - 11 gennaio 2010 : 16:32:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di robodont Invia a robodont un Messaggio Privato
ho visto ora le dimensioni delle immagini. Credevo il sistema avesse un modi di autoridimensionamento. La prossima volta farò assai più piccole mi scuso per la complicatezza nella visualizzazione

Roberto
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ukitel
Nuovo Arrivato



78 Messaggi

Inserito il - 11 gennaio 2010 : 16:36:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ukitel Invia a ukitel un Messaggio Privato
C'è il pulsante per modificare il messaggio e quindi ridimensionare l'immagine.
Comunque mi fa piacere che la cosa sia fattibile, e sia già stata fatta...
Ma quindi il tuo scopo qual è?
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 11 gennaio 2010 : 16:40:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato
aggiustato le immagini.
Basta aggiungere ad es.
|width=800
(o la larghezza che vuoi)
dopo il nome del file

Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui

My photo portfolio (now on G+!)
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robodont
Nuovo Arrivato



12 Messaggi

Inserito il - 11 gennaio 2010 : 16:57:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di robodont Invia a robodont un Messaggio Privato
Citazione:
Messaggio inserito da ukitel

C'è il pulsante per modificare il messaggio e quindi ridimensionare l'immagine.
Comunque mi fa piacere che la cosa sia fattibile, e sia già stata fatta...
Ma quindi il tuo scopo qual è?



Rifare la stessa cosa ma facendomi anche la parte biologica di laboratorio.
Mi sto facendo una cultura di coltura grazie a voi ;)

Mi serve capire se usando il mezzo di dulbecco e buttandoci dentro cellule di gengiva e curandone l'asepsi questi sia già sufficiente a far crescere layer cellulari
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ukitel
Nuovo Arrivato



78 Messaggi

Inserito il - 11 gennaio 2010 : 17:17:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ukitel Invia a ukitel un Messaggio Privato
Forse sono io a non aver capito bene, da come parli sembra che tu voglia creare così su 2 piedi un trial clinico di una procedura biotecnologica per allotrapiato umano che coinvolge numerosi esperti contemporaneamente... Però vuoi fare tu tutto da solo.
Scusami ma a questo punto queste domande te le devo fare:
Ti rendi conto dei rischi di fare una procedura del genere sull'uomo senza esperienza in materia?
Dove intendi farla, in che modo?
Hai a disposizione un laboratorio, attrezzature dove fare queste cose?
I permessi del comitato etico? Il trial clinico?

Cmq mettere le cellule in DMEM non serve a niente, semplicemente muoiono.
Le colture primarie hanno bisogno di condizioni molto particolari per crescere, ecco la necessità di un feeder layer o un mezzo condizionato.
Inoltre crescere in monolayer è diverso da far differenziare in un layer di epitelio.

Scusami, ma più si va avanti più viene confermato il fatto che sai molto poco dell'argomento e non riesco a immaginare come sia possibile da qualche notizia su un forum, raggiungere la conoscenza necessaria per fare quello che ti piacerebbe.
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robodont
Nuovo Arrivato



12 Messaggi

Inserito il - 11 gennaio 2010 : 18:40:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di robodont Invia a robodont un Messaggio Privato
mi pare che non vi sia voglia da pare di nessuno di voi di farmi capire e farmi imparare, ma di riprendere.
E' sempre così nei forum.
1 Non sai con che persona stai parlando, non sai chi io sia e le mie effettive possibilità
2 Io ho chiesto solo degli indizi per il resto quello che voglio fare rimane affare mio

..scusa ma mi infastidisce questo atteggiamento da universitario. Io amo l'approccio da bimbo entusiasta.
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


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Inserito il - 11 gennaio 2010 : 19:23:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato
Scusa robodont, non penso proprio ci volesse essere nessuna offesa da parte di ukitel nei tuoi confronti, ma voleva solo farti capire che la cosa è abbastanza complicata, forse molto di più di quanto tu possa pensare.

Non saprei dirti esattamente come fare per coltivare le cellule a cui sei interessato per il semplice fatto che non le ho mai coltivate e non ho ricercato nessun protocollo per farlo.
Però posso dirti che per coltivare delle cellule ci vogliono, oltre alla conoscenza del "metodo" anche altre 2 cose fondamentali:
1) la strumentazione adeguata (ad. es. cappa a flusso laminare, incubatore per le cellule, materiale sterile per colture cellulari...), questo non possiamo sapere se lo possiedi, ma molto probabilmente no a meno che tu non abbia un laboratorio, ma in quel caso ci sarebbero anche persone che ci lavorano.
2) un certo modo di lavorare (ad es. come lavorare in sterilità) che non si impara né sui libri né tanto meno su un forum.

Sinceramente credo che il consiglio migliore sia quello che ti ha dato uktiel all'inizio di contattare qualche laboratorio e chiedere il supporto pratico di qualche biologo o biotecnologo.
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ukitel
Nuovo Arrivato



78 Messaggi

Inserito il - 12 gennaio 2010 : 11:52:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ukitel Invia a ukitel un Messaggio Privato
Sinceramente mi dispiace di aver perso del tempo, e di non essere riuscito a far comprendere il livello di serietà, impegno e conoscenza richiesti dalla nostra professione presente o futura.
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robodont
Nuovo Arrivato



12 Messaggi

Inserito il - 12 gennaio 2010 : 14:25:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di robodont Invia a robodont un Messaggio Privato
Citazione:
Messaggio inserito da ukitel

Sinceramente mi dispiace di aver perso del tempo, e di non essere riuscito a far comprendere il livello di serietà, impegno e conoscenza richiesti dalla nostra professione presente o futura.



Io tempo non ne ho perso
Il livello lo ho compreso ma se non erro il mio primo post mirava a chiedere delucidazioni in merito a delle tecniche e non dei chiarimenti rispetto al lavoro di un biologo di gran competenza.
Se io faccio domanda A e mi si risponde risposta B vado in confusione, si generano problemi. Io mi sono chiaramente presentato dall'inizio come ignorante. Avrei potuto ricevere una risposta A per bimbi, ma cosa centra una risposta C o D o F?
Che psicologia sta alla base di questo atteggiamento? la paura che ti rubi il mestiere? certo che no! E allora perchè non spiegare come ad un bimbo che fare?

Alla fine ho risolto andandomi a leggere il testo di Rosati di citologia, scaricando gli articoli di referenza li ed altrove e condividendo i risultati con un amico biologo. Per altro l'amico era "assieme a me" da prima di iscrivermi qui per fare la domanda...
io davvero non capisco.

Adesso mi spiace davvero fare la figura del cafone e del cavallo pazzo, ma cavoli non è la prima volta che nei forum i big ti fanno sentire small invece di instradarti sulla retta via.

Io a 33 anni ormai ho il mio lavoro e la mia carriera non posso iscrivermi a biotecnologie ma nessuno mi vieta di approfondire.

Se ho offeso qualcuno.....
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ukitel
Nuovo Arrivato



78 Messaggi

Inserito il - 12 gennaio 2010 : 16:52:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ukitel Invia a ukitel un Messaggio Privato
Mi spiace, ma sei in errore. A meno che tu non abbia problemi ad esprimerti in italiano, quello che hai scritto è ben diverso.

Sin dal primo post è evidente che parli in prima persona, e tanto si capisce fino all'ultimo post in cui dichiari che non possiamo conoscere le tue possibilità e che quanto avresti voluto fare era affar tuo. Quindi è fuori di dubbio che avresti voluto applicare quanto hai detto. Cito alcune tue frasi ad esempio
Citazione:
...mi piacerebbe mettereci mani direttamente nella procedura
Citazione:
Rifare la stessa cosa ma facendomi anche la parte biologica di laboratorio
Persino dal titolo del topic è evidente che vuoi "fare".

Quindi non era una semplice richiesta di delucidazioni, che sarebbe stata legittima. Tu avresti voluto prelevare il campione, ricostuire la gengiva in vitro e suturarla al paziente.

Avresti voluto, cioè, fare un esperimento su un uomo senza sapere cosa stavi facendo. E per tua fortuna mi astengo dal continuare il commento.

Preferisco credere che tu sia un troll piuttosto che chi dici di essere.
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robodont
Nuovo Arrivato



12 Messaggi

Inserito il - 12 gennaio 2010 : 21:23:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di robodont Invia a robodont un Messaggio Privato
Citazione:
Messaggio inserito da ukitel


Preferisco credere che tu sia un troll piuttosto che chi dici di essere.



un po' di cordialità non guasterebbe..
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 13 gennaio 2010 : 19:55:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato
Non so quali fossero le intenzioni di robodont, se veramente mettere in piedi una coltura cellulare e impiantare tali cellule nei pazienti, nel qual caso capisco i "timori" espressi da ukitel.
Oppure se fosse veramente solo un'interesse "teorico", oppure ancora se ci sia la possibilità di fare questo lavoro in cooperazione con un "biologo" (come sembra dall'ultimo post di robodont) e sopratutto in un laboratorio attrezzato e certificato. Nel qual caso comunque rimarrebbe il fatto dell'impianto di tali cellule nei pazienti per il quale ci vorrebbero tutti i permessi necessari, visto che si tratterebbe di sperimentazione sull'uomo.
Ribadisco il fatto che non so molto dell'argomento specifico, e non avrei neanche tempo di mettermi a studiarlo o a cercare materiale.

Posso solo ribadire che per fare una cosa del genere (riferendomi solo alla parte di coltivazione delle cellule) c'è bisogno di personale addestrato e un laboratorio attrezzato come detto in precedenza.
E non si tratta di "accusarsi" di voler rubare il lavoro, ma semplicemente avere le conoscenze adeguate per farlo.

In ogni caso robodont, considerando tutte le tue "più buone" intenzioni per una cosa così specifica come quella che chiedi tu, e sopratutto se sai che è già stato fatto, la cosa migliore è leggersi la letteratura al riguardo, a meno che tu non conosca personalmente chi l'ha fatto e abbia la possibilità di contattarlo.
Poi se chiedi in generale "come si allestisce una colture cellulare", beh le cose da sapere come ti facevo già notare sono molte e c'è una bella differenza tra avere alcune nozioni "didattiche" su come farlo e farlo "praticamente".

Rimane il fatto che non sappiamo né chi tu sia né quali siano le tue reali intenzioni robodont, ma proprio per questo motivo caro ukitel qualunque idea tu ti sia fatto da questa discussione non è affatto gentile dare a qualcuno del troll senza avere l'assoluta certezza che sia tale. (e di troll qua ne abbiamo avuti!) Bisognerebbe comunque cercare di mantenere un certo tono in un forum e non offendere nessuno. E in questo caso mi riferisco ad entrambi!

Quindi per questo motivo e per il fatto che comunque questa discussione non approderebbe da nessun'altra parte abbiamo deciso di chiuderla.

Per quanto ti riguarda robodont spero che questo incidente non ti abbia fatto perdere la voglia di partecipare a questo forum in cui sei comunque il benvenuto.
Sperando che non si verifichino situazioni del genere nelle prossime discussioni.

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