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Ricciola
Nuovo Arrivato
38 Messaggi |
 Inserito il - 19 gennaio 2010 : 11:42:28
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ciao!
so che, purtroppo, la teoria è diversa dalla pratica, ma sapete indicarmi direttamente e/o un link in cui se ne parla di una regola empirica per la scelta del tempo di elongazione della taq riferito alle bp che si vogliono amplificare?
Io ho sentito dire 30 secondi ogni 1000 bp, ma vorrei verificare.
Grazie e buona giornata!
Paola
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 19 gennaio 2010 : 17:19:06
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Dovresti leggere sul foglio illustrativo dell'enzima che hai o direttamente sul sito web della casa da cui l'hai comprato. Se hai comprato l'enzima da qualche ditta seria ti dovrebbe dare tutte le istruzioni ed i protocolli con i riferimenti bibliografici completi. Li trovi lì.
Una Pfu si aggira intorno a circa 1000 bp al minuto, la Taq è effettivamente molto più veloce, ma conta che devi dare anche il tempo di iniziare la reazione ed alla soluzione di riscaldarsi e raffreddarsi ad ogni ciclo. Mediamente credo che una Taq a regime possa fare ben più di 5-6.000 basi al minuto, ma purtroppo non è facile arrivare una Taq oltre le 1-2.000 basi.
Ripeto che è una considerazione media fatta su una Taq standard, oggi girano diverse taq modificate per essere più rapide, o più efficaci, quindi potresti avere delle sorprese. Poi considera che la velocità di una polimerasi dipende anche dalla zona che va ad amplificare, le zone più ricche di GC sono più lente, le AT viceversa.
In genere metto 1 minuto per ogni 1000 bp, 30 secondi se <500bp. Non conviene scendere molto al di sotto di questa soglia soprattutto se la tua macchina di pcr non è velocissima a passare da una temperatura all'altra.
il riferimento che ho è questo
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8324500
in bocca al lupo
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Ricciola
Nuovo Arrivato
38 Messaggi |
Inserito il - 21 gennaio 2010 : 09:55:51
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| crepi e grazie per le indicazioni |
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