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sonyal
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3 Messaggi |
 Inserito il - 25 gennaio 2010 : 14:41:07
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Ciao a tutti.
Mi è stato chiesto di mettere su un protocollo per una tecnica che io non conosco: la multilocus sequence typing.
Qualcuno potrebbe spiegarmi come funziona?Posso fare una PCR multiplex e poi sequenziare oppure fare un unica PCR utilizzando un unico primer per i geni che devo analizzare (sono 7 geni hosekeeping con stessa T di annealing e stessa sequenza di basi) e poi fare 7 reazioni di sequenza?
Come mi conviene procedere?
Scusate ma sono solo una neo-laureata con poca esperienza!!!
Grazie
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
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sonyal
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3 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2010 : 15:30:53
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Di bibliogarfia ne ho letta tanta, ma il problema è che i lavori bibliografici sono come una matriosca!!!
Non ho tovato un protocollo dettagliato, ovviamente...
Cmq grazie 1000 per i tuoi suggerimenti.
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amicia
Nuovo Arrivato
24 Messaggi |
Inserito il - 26 gennaio 2010 : 14:02:12
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Scusa, magari ti dico delle cose che sai già, in ogni caso l'idea della tecnica MLST è quella di andare ad analizzare se, all'interno di regioni che presentano corte (di solito) sequenze altamente ripetute, il numero di queste sequenze ripetute varia. Se hai delle sequenze ripetute corte (a volte anche una singola base può essere l'unità base di queste sequenze ripetute) sei costretto a sequenziare la regione di interesse (da cui il nome multilocus sequencing tandem repeats), altrimenti non riesci a capire se differiscono, ma, per se hai delle unità base più lunghe (da tre a 20-30) puoi semplicemente fare un gel per riuscire a cogliere queste differenze (in questo caso si chiama multilocus variable nucleotide tandem repeats analysys, ma è una definizione che prenderei con le molle perchè poi spesso trovi la stessa cosa chiamata in modi diversi).
Se sequenzi, puoi vedere direttamente il numero di ripetizioni in sequenza e denominerai il locus sulla base delle ripetizioni dell'unità base. Mentre se vai su gel devi conoscere la lunghezza della unità base delle tua ripetizione e le sequenze fiancheggiatrici. Matematicamente devi sottrarre la lunghezza delle sequenze fiancheggiatrici alla lunghezza dell'amplificato in PCR che ottieni e dividerlo per la lunghezza della tua unità base. Ti viene fuori un numero che definerà quante sequenze ripetute ci sono per quel locus.
Va da se che con il sequenziamento sei molto piu sensibile perchè puoi trovare anche dei polimorfismi e in generale ottieni un discriminatory index più alto.
I protocolli che trovi in letteratura sono molto vari, ma tutti si basano su questo concetto. Ovviamente, se cercati un paper che fa piu o meno le cose che ti interessano e comincia da quello per poi affininare la ricerca quindi passa sul banco di lavoro. Resta sottointeso che le tue sequenze devono avere al loro interno delle tandem repeats. Per sapere se le hanno prova ad usare tandem repeat finder.
Secodno me ti conviene incominciare con un locus e poi procedere con gli altri.
Scusa per la lunghezza, spero di essere stato almeno un po chiaro e non averti fatto ancora piu confusione. |
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sonyal
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 26 gennaio 2010 : 15:44:12
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Grazie, la tua risposta è stata esaustiva.
La lunghezza della regione di interesse l'ho ricavata dal database mlst.net.
Quindi a questo punto dovrei mettere a punto il mio protocollo sul banco e vedere cosa succede?
Speriamo bene...
1000 grazie!!! |
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