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Federicax1989
Utente Junior
316 Messaggi |
 Inserito il - 29 gennaio 2010 : 15:25:40
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Mi spiegate la differenza tra un dosaggio enzimatico semplice e uno accoppiato?? e cosa c'entra il NADH nei dosaggi.Grazie
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M111
Utente
Prov.: Lucca
Città: Guamo
838 Messaggi |
Inserito il - 30 gennaio 2010 : 10:00:05
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Se non ho capito male la tua richiesta.
Per dosaggio accoppiato intendi l'utilizzo di enzimi ancillari?
Nel senso, reagenti e prodotti di una determinata reazione sono mal misurabili, ad esempio la reazione catalizzata dalla alaninaammino transferasi, alanina + alfaketoglutarato <-> Glutammato + piruvato
Gl spettri di questi assorbono poco in UV e visibile, allora si fa il dosaggio ricorrendo ad un altro enzima in miscela, esempio, la lattato deidrogenasi trasforma il piruvato in L-lattato portando in NADH a NAD+, sfruttando la differenza negli spettri di questi due ultimi a 340 nm vedi il dA/dt.
Gli enzimi ancillari possono esser anche più di uno.
La cosa fondamentale di tutto questo è che la velocità che ci interessa è quella della prima reazione, allora il secondo enzima dovrà esser in forte eccesso, la reazione che si vuol misurare deve esser la limitante :)
Nel saggio in questione si dovrebbe mettere, Ala, alfaKetoglutarato, ALT, LDH, NADH, ovviamente tampone, e poi acqua per arrivare a volume desiderato.
Quello che ti ho fatto era solo uno dei milioni di esempi disponibili, mi è venuto in mente perchè l'avevo fatto poco tempo fa... |
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Federicax1989
Utente Junior
316 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2010 : 15:31:41
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Citazione:
Messaggio inserito da M111
Se non ho capito male la tua richiesta.
Per dosaggio accoppiato intendi l'utilizzo di enzimi ancillari?
Nel senso, reagenti e prodotti di una determinata reazione sono mal misurabili, ad esempio la reazione catalizzata dalla alaninaammino transferasi, alanina + alfaketoglutarato <-> Glutammato + piruvato
Gl spettri di questi assorbono poco in UV e visibile, allora si fa il dosaggio ricorrendo ad un altro enzima in miscela, esempio, la lattato deidrogenasi trasforma il piruvato in L-lattato portando in NADH a NAD+, sfruttando la differenza negli spettri di questi due ultimi a 340 nm vedi il dA/dt.
Gli enzimi ancillari possono esser anche più di uno.
La cosa fondamentale di tutto questo è che la velocità che ci interessa è quella della prima reazione, allora il secondo enzima dovrà esser in forte eccesso, la reazione che si vuol misurare deve esser la limitante :)
Nel saggio in questione si dovrebbe mettere, Ala, alfaKetoglutarato, ALT, LDH, NADH, ovviamente tampone, e poi acqua per arrivare a volume desiderato.
Quello che ti ho fatto era solo uno dei milioni di esempi disponibili, mi è venuto in mente perchè l'avevo fatto poco tempo fa...
non e' proprio la spiegazione che volevo.Cmq penso di aver capito alla fine quindi va bene cosi'.In effetti i miei dubbi sono sempre un po' incomprensibili |
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M111
Utente
Prov.: Lucca
Città: Guamo
838 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2010 : 19:56:41
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Vabè....magari non ho capito la tua domanda, anzi sicuramente non l'ho fatto :)
Si trattava di enzimi ancillari? |
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Federicax1989
Utente Junior
316 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2010 : 13:49:02
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Citazione:
Messaggio inserito da M111
Vabè....magari non ho capito la tua domanda, anzi sicuramente non l'ho fatto :)
Si trattava di enzimi ancillari?
ok ti dico quello che ho capito io cosi' magari me lo puoi ridire in modo + corretto:
Un saggio enzimatico serve 1) per misurare l'attivita' di un enzima,ovvero la velocita' di una reazione catalizzata e lo fa misurando la quantita ' di substrato trasformato in prodotto nel tempo 2) per conoscere la quantita' di prodotto o di substrato.
Un saggio sfrutta quindi alcune proprieta' quali l'assorbanza(saggio spettrofotometrico) e la fluorescenza(saggio spettrofluorimetrico)
Il saggio spettrofotometrico quindi si basa sulla formazione di un prodotto colorato ed e' essenziale che substrato e prodotto abbiano colori diversi quindi spettri di assorbimento diversi.
Un saggio spettrofluorimetrico misura invece la fluorescenza del prodotto.
Talvolta si sfrutta invece la differenza nello spettro del NAD+ e NADH o viceversa,se l'enzima e' NAD-dipendente.
Se substrato e prodotto non sono otticamente distinguibili e se l'enzima non e' NAD-dipendente si fa uno saggio accoppiato,cioe' si accoppiano due reazioni con un intermedio comune..e nella seconda si usa un enzima ausiliare NAD-dipendente.
Ecco e' questo quello che dovrei sapere penso..non ho trovato niente su internet a questo basso livelloxD ho un po' dedotto io..
PS . potresti anche descrivermi cosa avviene in questo dosaggio dove si forma un prodotto fluorescente ..chi riduce chi si ossida ?@.@ qual e' l'enzima?
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