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mastrascia
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20 Messaggi

Inserito il - 14 giugno 2006 : 16:30:45

potreste aiutarmi a capire qual � il meccanismo del "sequence chromatograms", per sequenziare il DNA.
grazie a tutti

kORdA
Utente Attivo

Prov.: Milano
Citt�: Monza

1303 Messaggi

Inserito il - 14 giugno 2006 : 22:40:51

Quello che intendi tu in realta' e' una versione un po' piu' elegante del metodo di sequenziamento di Sanger.

Tale metodo si basa sulla ricostruzione dell�elica complementare a quella che si vuole sequenziare, utilizzando il frammento di Klenow (ottenuto dalla DNApolimerasi I) ed un opportuno primer.
La reazione viene condotta su 4 aliquote, ciascuna delle quali contiene un tipo di di-desossi-nucleotide che, quando viene incorporato durante la sintesi del DNA, blocca l�allungamento della catena.
Ciascuna aliquota conterra' frammenti di varia lunghezza terminanti con lo stesso ddNTP. I frammenti cos� ottenuti vengono separati con elettroforesi e autoradiografia.
Solitamente si spezza la sequenza da identificare in pi� frammenti (per sonicazione o con endonucleasi) per semplificarne l�analisi.

La variante che intendi tu prevede che i ddNTP siano marcati con 4 cromofori che assorbono a lunghezze d�onda diverse (invece che procedere con la radiomarcatura).
I frammenti ottenuti vengono solitamente separati tramite elettrocromatografia (un tipo di elettroforesi capillare, da qui ottieni il cromatogramma). Lo spettrofotometro posto sulla finestra di campionamento del capillare misura l'intensit� di assorbimento alle quattro lunghezze d'onda dei cromofori.

A seconda del colore assorbito dal frammento risalgo al tipo di ddNTP incorporato.

http://www.linkedin.com/in/dariocorrada