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gatsu01
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 03 febbraio 2010 : 17:38:22
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Salve sono nuovo e non so se sto scrivendo nella sezione giusta!
La mia domanda è questa:
La prof a lezione ha detto che quando costruisco un vettore plasmidico, per la produzione della proteina ricombinante Cu/Zn-SOD umana in ospite di lievito (Saccaromyces Cerevisiae), il cDNA della Cu/Zn-SOD (che non ha introni proprio perchè CDNA)e che bisogna integrare nel vettore deve però contenere ALMENO UN INTRONE. Le mie domande sono:
- Perchè c'è bisogno di almeno di un introne?
(io credevo per l'attraversamento della membrana nucleare ma è impossibile perchè nel nucleo l'mRna viene già maturato)
- come si fa ad inserire nel vettore la sequenza di un introne affianco/dentro alla sequenza del cDNA che ne è (presumo) privo?
P.S.:Dal file allegato è molto più chiaro javascript:insertsmilie(' ')
Ringrazio tutti in anticipo per la risposta!
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
 Inserito il - 04 febbraio 2010 : 11:58:26
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Citazione:
Messaggio inserito da gatsu01
La mia domanda è questa:
La prof a lezione ha detto che quando costruisco un vettore plasmidico, per la produzione della proteina ricombinante Cu/Zn-SOD umana in ospite di lievito (Saccaromyces Cerevisiae), il cDNA della Cu/Zn-SOD (che non ha introni proprio perchè CDNA)e che bisogna integrare nel vettore deve però contenere ALMENO UN INTRONE. Le mie domande sono:
- Perchè c'è bisogno di almeno di un introne?
(io credevo per l'attraversamento della membrana nucleare ma è impossibile perchè nel nucleo l'mRna viene già maturato)
Sinceramente non me ne intendo di lievito, però in generale l'introne non è necessario per l'espressione di un cDNA, tuttavia spesso si rende necessario perché il complesso proteico che si viene a formare nel nucleo (detto spliceosoma) protegge l'RNA dalla degradazione, lo stabilizza e rende più efficiente il sistema di esportazione verso l'esterno del nucleo e quindi la traduzione proteica.
Quindi in generale non è proprio strettamente necessario, ma spesso migliora notevolmente il sistema. Non so se il lievito faccia eccezione a questa regola.
Citazione:
Messaggio inserito da gatsu01
- come si fa ad inserire nel vettore la sequenza di un introne affianco/dentro alla sequenza del cDNA che ne è (presumo) privo?
Niente di più semplice, basta prendere una sequenza intronica nota, ed inserirla in un punto a caso del tuo cDNA. La sequenza già contiene tutte le informazioni per essere riconosciuta ed eliminata dal cDNA, quindi facile. Tuttavia, visto che in alcuni rari casi si è avuto l'espressione di mRNA aberranti, poiché ci potrebbero essere delle mutazioni nell'introne o problemi di diversa natura (es ripiegamenti tridimensionali), spesso i ricercatori preferiscono mettere l'introne nelle regioni che sono presenti nell'mRNA finale e non sono tradotte in proteina (es: 5'UTR o 3'UTR).
Buono studio
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 04 febbraio 2010 : 15:46:48
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Non conosco la risposta del caso specifico, ma so che
alcuni trascritti sono particolarmente instabili e la
loro esportazione nucleare richiede un "accompagnamento"
da parte dello spliceosoma, durante il processo di esportazione,
cosa che può accadere - ovviamente - solo se il trascritto
contiene almeno un accettore ed un donatore di splicing.
In H. sapiens il caso esemplare è quello del gene della beta-globina,
che non può essere espresso come cDNA in un sistema ricombinante
in quanto necessita strettamente di introni, e non introni a caso
ma proprio i suoi (complice pure il fatto che contengono elementi
enhancers cruciali sia per il transcription start che per lo splicing).
Senza di essi i livelli di trascritto steady state rimangono
bassissimi e quindi l'espressione diviene insignificante.
Non so se sia così anche per il lievito.
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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gatsu01
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 04 febbraio 2010 : 17:29:11
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Un grazie mille a neuroscience che è stato chiarissimo e esauriente ed altrettanto a Dionysos che mi ha aperto la mente su vari scenari!!!
Ps: nn so se devo fare qualcos'altro tipo chiudere la discussione o altro, nel caso basta farmelo sapere |
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Perkè nel vettore ci deve essere almeno 1 introne?
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