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kk74
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23 Messaggi

Inserito il - 03 febbraio 2010 : 20:25:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di kk74 Invia a kk74 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
sapreste dirmi quale è il metodo migliore per allestire una RT-PCR semiquantitativa "accurata" dato che non ho a disposizione una real-time?
grazie

kk74
Nuovo Arrivato



23 Messaggi

Inserito il - 04 febbraio 2010 : 18:50:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di kk74 Invia a kk74 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
è giusto secondo voi se:amplifico la GAPDH o la b-actina a 25 cicli, (per esempio), poi con imageJ valuto le densità delle bande, successivamente aggiusto i microlitri di cDNA in base ai rapporti che ottengo da imageJ, ed infine faccio la rt-pcr dei markers che mi interessano?
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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 04 febbraio 2010 : 20:13:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io l'ho fatto nel mio vecchio laboratorio ma è stato
un total failure. In pratica una volta 'standardizzata'
la metodica di estrazione RNA e retrotrascrizione, ho
provato ad amplificare il mio cDNA d'interesse con
un numero crescente di cicli per cercare di individuare
la regione di linearità dell'amplificazione e per capire
quand'è che subentrava la saturazione del segnale di banda.
Anche io facevo beta-actina a 25 cicli e poi la rapportavo
per avere la normalizzazione usando ImageJ. Però in pratica
non sono mai riuscito a metterla a punto, perchè ogni volta
che rifacevo l'estrazione il numero di cicli a cui la banda
iniziava a esistere e il numero a cui saturava, cambiavano...

Non ho capito cosa intendi per "aggiusto i microlitri",
spero che tu non intenda la quantità di cDNA templato... :/

Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!


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neurodue
Nuovo Arrivato



5 Messaggi

Inserito il - 04 febbraio 2010 : 20:20:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di neurodue Invia a neurodue un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
uuhhhmmm sono dubbiosa... nella teoria si potrebbe, ma secondo me non sarai mai cosi preciso, anche perchè solo un ciclo di differenza (a cui esce un tuo cDNA) ti può dare valori di espressione molto diversi tra due campioni... quindi non direi che sia il metodo migliore... una real time sarebbe l'ideale...

anche perchè house keeping come actina e gapdh saranno molto espressi e quindi su un gel vedrai un forte segnale... e chi non ti dice di essere andato a saturazione? quindi diventerebbe difficile normalizzare i campioni in questo modo...
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kk74
Nuovo Arrivato



23 Messaggi

Inserito il - 04 febbraio 2010 : 21:11:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di kk74 Invia a kk74 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non ho capito cosa intendi per "aggiusto i microlitri",
spero che tu non intenda la quantità di cDNA templato... :/

No, assolutamente no. sono i microlitri di cDNA che uso prima della RT-PCR specifica per i marcatori di mio interesse. in pratica faccio quello che facevi nel vecchio lab.
Che alternativa ci potrebbe essere (oltre alla real time che non posso usare)?
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 05 febbraio 2010 : 00:03:52  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
PCR competitiva!
Esistono anche vari kit in commercio.
Ora non ho tempo di dilungarmi troppo, ma se cerchi nel forum c'era una discussione in cui s parlava dei vari metodi di PCR quantitativa e semiquantitativa.

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michy2
Nuovo Arrivato




44 Messaggi

Inserito il - 09 febbraio 2010 : 14:45:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di michy2 Invia a michy2 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
oppure il caro vecchio northern
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