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so84
Nuovo Arrivato
Prov.: roma
Città: roma
9 Messaggi |
 Inserito il - 09 febbraio 2010 : 13:40:41
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Ciao a tutti,io avrei bisogno di un aiuto...
vorrei sapere in che modo posso separare le cell staminali e se conoscete degli strumenti specifici di facile utilizzo. Vi chiedo, inoltre, di darmi indicativamente delle info sui vantaggi e svantaggi di questi strumenti in modo da potere avere un'idea chiara sul loro utilizzo ed efficienza.
Grazie di cuore e buon pomeriggio a tutti
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michy2
Nuovo Arrivato
44 Messaggi |
Inserito il - 09 febbraio 2010 : 13:46:56
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| beh dipende da dove le vuoi isolare......midollo?sangue? cordone? |
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so84
Nuovo Arrivato
Prov.: roma
Città: roma
9 Messaggi |
Inserito il - 09 febbraio 2010 : 16:37:08
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| Hai ragione...mi sono dimenticata di scriverlo!!! Le devo isolare dal sangue |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2010 : 01:27:29
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hai un cell sorter?  |
Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
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michy2
Nuovo Arrivato
44 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2010 : 12:02:46
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| puoi provare a fare un gradiente ficoll....il primo strato al 100% il secondo al 70% e poi puoi decidere tu, più strati fai meglio è.. lo strato che devi prelevare è quello intermedio li ci dovrebbero essere le staminali, mentre sul fondo finiscono i globuli rossi |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2010 : 13:18:33
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Non per smentire michy2, ma dubito fortemente che troverai
un numero detectabile di "staminali" in generico "sangue".
Per isolare generici precursori ematopoietici indifferenziati
(da uomo? da topo?) la cosa migliore è usare colonnine per beads
magnetiche coniugate ad anticorpi. CD34 nell'uomo, un cocktail di
lineage antigens per il topo. Però si parte da sangue MOBILIZZATO,
cioè arricchito in precursori a seguito di mobilizzazione del midollo,
oppure dal midollo osseo stesso. Non certo da sangue periferico.
(unica eccezione: il sangue da cordone ombelicale umano, che
è arricchito naturalmente in precursori CD34+)
Per isolare le STAMINALI ematopoietiche (propriamente dette,
a patto che siano state funzionalmente definite..) allora
puoi ricorrere soltanto al cell sorting tramite marcatura
con più antigeni. Nell'uomo il pannello anticorpale più usato
è CD34/CD38/CD45, di solito (sono arricchite nei gating della
regione 34+/38-/45low). Nel topo invece si usa l'arricchimento
KSL (Kit+/Sca+/Lin-) ma il pannello migliore è lo SLAM di Weissman.
Nota che ho parlato di arricchimento. L'"isolamento di staminali
del sangue", purtroppo, non è (ancora) cosa di questo mondo. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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michy2
Nuovo Arrivato
44 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2010 : 14:00:31
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si infatti ho detto provare
anche con il sorting è difficile rinvenire staminali dal periferico, ma se vuole fare una prova è certamente meno costoso di un anticorpo...ovviamente l'ideale sarebbe partire da midollo o cordone |
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ukitel
Nuovo Arrivato
78 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2010 : 15:39:02
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Dionysos, è veramente necessario isolare tramite cell sorting con quel pannello?
Molte pubblicazioni isolano da midollo cellule ematopoietiche staminali semplicemente tramite separazione immunomagnetica su colonna con anticorpo CD34+.
Inoltre mi pare che la separazione immunomagnetica sia capace di isolare un numero più consistente di cellule, a un costo molto minore rispetto al sorting.
Sono molto interessato all'argomento. |
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so84
Nuovo Arrivato
Prov.: roma
Città: roma
9 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2010 : 16:16:12
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Io dovrei acquistare un separatore magnetico cellulare MACS,quindi volevo sapere se mi conviene come strumento o se ce ne sono degli altri,in quanto sono poco informata circa ciò che occorre x separarle.Mi hanno detto che con il separatore MACS ho un'alta purezza ma la resa finale è molto bassa...qualcuno potrebbe consigliarmi?
Grazie |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2010 : 19:59:11
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Citazione:
Molte pubblicazioni isolano da midollo cellule ematopoietiche staminali semplicemente tramite separazione immunomagnetica su colonna con anticorpo CD34+.
Questo è solo parzialmente vero.
La popolazione CD34+ umana contiene ANCHE staminali, non
rappresenta "LE" staminali, ma ne contiene una parte
corrispondente ad una quota variabile, a seconda della fonte
ma sempre piuttosto bassa (quasi sempre inferiore al 20%).
Le restanti cellule sono per lo più progenitori indifferenziati,
distinti in progenitori multipotenti, MPP (clonogenici, come le
staminali, ma incapaci di autorinnovarsi e incapacidi ripopolare
un sistema ematopoietico in un trapianto) e progenitori committed,
che a breve finiranno irrimediabilmente col differenziarsi in un
ristretto tipo di cellula del sangue. Infine la quota CD34+ può
contenere anche cellule endoteliali contaminanti, dato che il
midollo osseo ne è ricco, ma dipende ovviamente dalla procedura.
Quindi non è vero che con la colonnina si isolano le staminali
ematopoietiche ma è vero che si isola una popolazione di
precursori ematopoietici indifferenziati in cui le
staminali hanno un basso (seppur visibile) arricchimento.
Citazione:
Molte pubblicazioni isolano da midollo cellule ematopoietiche staminali semplicemente tramite separazione immunomagnetica su colonna con anticorpo CD34+.
Inoltre mi pare che la separazione immunomagnetica sia capace di isolare un numero più consistente di cellule, a un costo molto minore rispetto al sorting.
Sono molto interessato all'argomento.
Sono due cose diverse: la separazione immunomagnetica
permette di isolare le cellule sulla base di UN solo
antigene, e che sia di membrana.
Il problemone che sorge è il seguente: molte popolazioni
funzionali, tra cui le medesime HSC (hematopoietic stem cells)
sono state definite e descritte sulla base non di un solo antigene,
ma di MOLTI determinanti, antigenici e non (ad es. l'Hoechst).
Inoltre se anche tu come me devi fare trasduzioni con sistemi
reporter (GFP, mO2, cherry..) le separazioni immunomagnetiche
sono solamente utili per reporter genes di membrana (ad es.
NGFR) e non permettono di isolare le popolazioni cellulari
sulla base di parametri multipli (ad es. GFP+, mO2-, NFGR+, ecc.)
Citazione:
Io dovrei acquistare un separatore magnetico cellulare MACS,quindi volevo sapere se mi conviene come strumento o se ce ne sono degli altri,in quanto sono poco informata circa ciò che occorre x separarle.Mi hanno detto che con il separatore MACS ho un'alta purezza ma la resa finale è molto bassa...qualcuno potrebbe consigliarmi?
Noi usiamo il sistema MACS e abbiamo una purezza di CD34+
vicina al 99%, con una quota di putative staminali vicina
al 19% al citofluorimetro. La resa è quella che è, non so
se esistano metodi per avere una resa drammaticamente più alta.
Noi estraiamo da cordone ombelicale col MACS e siamo soddisfatti.
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 11 febbraio 2010 : 01:52:26
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se il sorter lo sai usare (= non ti crepano le cellule pechè usi una pressione troppo elevata ecc) ottieni cellule sicuramentre molto più pure di quanto puoi fare su colonnina (lo dico per esperienza sull'una e sull'altra) in più il sorter ti permette di mediare tra purezza e resa..sicuramente le colonnine o un automacs costano meno e funzionano bene ma al massimo puoi fare una doppia selezione (es negativa per Thy1, positiva per CD34) e oltretutto riduci di molto la resa, mentre col sorter puoi guardarti 4-5 o più marcatori contemporaneamente che ti permettono di discriminare meglio quali sono realmente le HSC (in linea di massima CD34+, Thy1 low, c-kit+/low, CD33-, CD38-, lineage-), che come diceva giustamente Dionysos non sono rappresentate solo dalle cellule CD34. Per molti anzi la vera HSC non è nemmeno CD34+..solo che comunque prendendo le CD34+ dal periferico di un soggetto mobilizzato siamo in grado di ricostituire l'emopoiesi midollare, e quindi per approssimazione dire CD34 va bene, solo che dipende da cosa ci devi fare.
E nel periferico (in soggetto non mobilizzato) sono comunque meno dello 0,1% della cellularità totale |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 11 febbraio 2010 : 01:57:43
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@ Dyonisos ovviamente non intendo che il tuo 99% di purezza da colonnina non sia lo so che lavorando su cord è fattibilissimo il problema è che nel PB le staminali sono eventi rari e come tali dubito che si possa avere una purezza così alta con la colonnina. Comunque per so84 per ordinare una colonnina e l'anticorpo bigliato antiCD34 non ci vuole chissà che budget, puoi fare una prova..magari facendo poi anche dei test funzionali sulle cellule isolate si riesce a tirar fuori un numero decente di putative staminali  |
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