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 Gel di agarosio congelato!!
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zelos1
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Occhio!
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31 Messaggi

Inserito il - 12 febbraio 2010 : 11:06:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di zelos1  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di zelos1 Invia a zelos1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti
Ho un problema con un gel di agarosio: ho congelato a -20 due bande per estrarre il DNA il giorno dopo.
Sto tenendo ora il gel in eppendorf a bagno in acqua a 60 gradi da quasi un ora, e non si liquefa! Mi sorge il dubbio che non si possa fare..qualcuno ha mai provato??
Grazie in anticipo

zelos1
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Occhio!

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31 Messaggi

Inserito il - 12 febbraio 2010 : 12:09:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di zelos1  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di zelos1 Invia a zelos1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Alternativamente-c'è una maniera di recuperare il DNA dal gel non liquefatto, quindi la fettina ancora solida?
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jeje
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52 Messaggi

Inserito il - 13 febbraio 2010 : 19:05:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di jeje Invia a jeje un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao io usavo un kit quiagen e usavo direttamente agorosio solido.ma non congelato!
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 13 febbraio 2010 : 19:40:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ma perchè l'hai congelato? Non ti conveniva conservarlo a 4°C fino al giorno dopo?
Sinceramente io non ho mai congelato un gel di agarosio.
Comunque esistono vari kit per estrarre il DNA da gel di agarosio, esistono anche protocolli manuali ma non ne ho qua dovrei cercare.
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zelos1
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Occhio!

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31 Messaggi

Inserito il - 14 febbraio 2010 : 03:23:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di zelos1  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di zelos1 Invia a zelos1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
In realtà è stato un errore, andava conservato a 4°, invece l'hanno messo ha -20!!
Cmq lunedì provo di nuovo a scioglierlo a 60° come da protocollo, se non funziona butto tutto e rifaccio!!
Grazie per l'aiuto comunque!
A presto
PS per gfpina: conosci una certa Cinzia che lavora ad Helsinki??
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


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Inserito il - 14 febbraio 2010 : 10:17:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh comunque sembra che si possa, qua descrivono un protocollo: Recovery of polymerase chain reaction products from frozen agarose gels
Fammi sapere nel caso tu non possa accedere all'articolo, in ogni caso non dicono niente di speciale, lo fanno semplicemente scongelare a Tamb e poi utilizzano un kit per l'estrazione come da gel fresco.

Citazione:
Messaggio inserito da zelos1

PS per gfpina: conosci una certa Cinzia che lavora ad Helsinki??

No mi spiace non la conosco, ma di Italiani qua ce ne sono molti.
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zelos1
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Occhio!

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31 Messaggi

Inserito il - 14 febbraio 2010 : 10:56:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di zelos1  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di zelos1 Invia a zelos1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
No, non posso accervi, l'ho già richiesto dalla biblioteca ma ci mette un po' di tempo ad arrivare! Comunque se la procedura è sempre quella..niente di nuovo!
Grazie gfpina, chiedevo perchè Cinzia era una mia collega di studi, e per ora in erasmus dovrebbe esserci anche una certa Erika.
Se le vedi, salutamele, da parte di Manuel
Ciao ciao
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 14 febbraio 2010 : 11:06:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh comunque te lo invio tramite messaggio privato.

Mi spiace ma non credo incontrerò mai né Cinzia né Erika, oggi è il mio ultimo giorno ad Helsinki, peccato!



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RNA world
Utente Junior

dna



370 Messaggi

Inserito il - 14 febbraio 2010 : 12:31:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di RNA world Invia a RNA world un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
certo che si può congelare un gel d'agarosio. per estrarre il dna devi semplicemente aggiungere il buffer n.1 di un qualsiasi kit per estrazione e metterlo a 50 gradi per 7 minuti.
poi colonnina d'estrazione e via. non ci credo che nel tuo lab nessuno ha un qualsiasi kit per purificare frammenti di dna. e cmq è meglio metterlo a -20 che a 4 gradi.

ciao
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 14 febbraio 2010 : 13:07:45  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sinceramente io non lo avevo mai sentito, ho sempre estratto da gel freschi che comunque credo sia la cosa migliore, ma anche a leggendo l'articolo pare che non ci sia una sostanziale perdita di DNA.
Io comunque preferirei nel caso conservare i prodotti di PCR congelati che non il gel.

Il fatto di metterlo a 4°C comunque va bene se lo devi tenere solo overnight, io ho conservato gel a 4°C o/n per problemi tecnici al transilluminatore e le bande il giorno dopo erano comunque belle.
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zelos1
Nuovo Arrivato

Occhio!

Prov.: Palermo
Città: Palermo


31 Messaggi

Inserito il - 14 febbraio 2010 : 15:31:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di zelos1  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di zelos1 Invia a zelos1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
In realtà il kit dice di liquefare il gel e dopo aggiungere il buffer uno. Quello che usiamo è quello della "EZNA", ha sempre funzionato bene..Comunque domani proviamo e vediamo che succede.
Grazie sempre per le risposte!!
Manuel
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zelos1
Nuovo Arrivato

Occhio!

Prov.: Palermo
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31 Messaggi

Inserito il - 15 febbraio 2010 : 16:07:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di zelos1  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di zelos1 Invia a zelos1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ok, per la cronaca funziona!
Mancava il buffer uno per farlo scogliere..grazie a tutti,
Ciao
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prossima biologa
Utente Attivo

0625_da_la_fra



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Inserito il - 09 marzo 2010 : 18:29:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di prossima biologa Invia a prossima biologa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
noi usavamo il kit quiagen ma quando lo abbiamo terminato e ci sono finiti i soldi abbiamo applicato nuovo protocollo:
La banda contenente l’amplificato è stata escissa con bisturi e il DNA eluito in 150 µl di acqua mQ e lasciato a 4°C per 3 giorni.
Quindi ho aggiunto 75 µl di Eluition Buffer 2X (Na-acetato 0.5M a pH7 e EDTA 1mM a pH 8), ho prelevato la soluzione a cui ho aggiunto isopropanolo-potassio acetato e ho lasciato per 2 ore a -20°C; ho centrifugato a 13.000 rpm per 15 min; al sedimento ho aggiunto alcool al 70% e lasciato la soluzione per 2 ore a -20°C. Dopo essiccamento in Savant al sedimento è stato aggiunto 100 µl di acqua mQ e un volume di cloroformio-alcool isoamilico, 24:1 e ho centrifugato 10 min a 12.000 rpm, quindi ho prelevato il surnatante e ad esso ho aggiunto 2 volumi di alcool 100% a freddo. Ho velocemente agitato la soluzione sul vortex e posto a -80°C per due ore. Ho quindi centrifugato a 12.000 rpm per 10 min, lavato in alcool 70% a freddo, centrifugato per 10 min a 12.000 rpm, decantato e savantato. Ho reidratato con 20 µl di acqua mQ ed effettuato lettura al nanodrop.

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prossima biologa
Utente Attivo

0625_da_la_fra



1437 Messaggi

Inserito il - 09 marzo 2010 : 18:33:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di prossima biologa Invia a prossima biologa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
scusate se ho fatto copia incolla dalla mia tesi e magari ci sono alcune cose che possono nn essere pertinenti, tipo lettura al nanodrop ecc. cmq questo protocollo fu usato da noi... ora mi sto rendendo però conto che tu intendevi che mettevi a -20 la banda, quindi ops... sorry per protocollo poco pertinente!

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 09 marzo 2010 : 19:19:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh se vuoi comunque il protocollo puoi inserirlo nella sezione protocolli: http://www.molecularlab.it/protocolli/
potrebbe comunque risultare utile a qualcuno!
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prossima biologa
Utente Attivo

0625_da_la_fra



1437 Messaggi

Inserito il - 09 marzo 2010 : 21:03:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di prossima biologa Invia a prossima biologa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ok gfpina lo posto subito!!

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