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cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
 Inserito il - 24 febbraio 2010 : 16:15:57
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ciao a tutti!
spero che non esista già una discussione di questo tipo nel forum...
mi chiedevo se qualcuno potesse aiutarmi a togliermi un piccolo pallino che mi è venuto riguardo le trasfezioni.
il mio problema è questo.. dopo millemila tentativi, sono riuscita a trovare delle buone condizioni di trasfezione per le mie cellule, che sono un po' ostiche... ho fatto più prove per confermare il dato e sono abbastanza sicura che la mia efficienza di trasfezione con la GFP sia intorno al 60-65%. a questo punto sono andata a trasfettare p53, e ho fatto un western per confermare la sua espressione... posto che sto avendo delle serie difficoltà con gli anticorpi, comunque l'esito della trasfezione non mi sembra proprio esaltante... visto il modello su cui lavoro, questo può dipendere da 10000 motivi diversi, però nel frattempo mi è sorto questo dubbio.. il plasmide pEGFP, usato per le prime prove, è di circa 3,4 kb, mentre invece il plasmide per p53, è di circa 5,6 kb, allora mi domando: quanto influisce la grandezza del costrutto sull'efficienza di trasfezione?
io utilizzo il Fugene, quindi il protocollo mi dice di prendere una data quantità di DNA espressa come microgrammi, ma se la grandezza dei plasmidi che utilizzo è molto diversa, allora il loro peso sarà molto differente, e quindi a parità di microgrammi, potrei ritrovarmi una quantità di plasmide anche molto inferiore (nel mio caso), perciò mi chiedo se questo influenza la mia efficienza di trasfezione, e se si, allora dovrei ragionare in molarità piuttosto che in peso, no? e come faccio a calcolarmi il peso molecolare di un plasmide? impazzisco su maree di formule per settimane e settimane valutando la lunghezza e la composizione della mia sequenza o c'è un sistema un po' più semplice che mi consenta un'approssimazione?
sono stata prolissa? scusate... comunque, la mia domanda è: il mio è un pippone mentale inutile oppure ha un senso?
grazie...
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 25 febbraio 2010 : 12:00:22
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| Anch'io lavoro da poco sulla trasfezione di cellule...è utilizzo il pEFGP come plasmide. Pero quello che non capisco del tuo lavoro, scusa l'ignoranza, é perché lavori con 2 plasmidi diversi? cioé ad esempio il plasmide che utilizzo io possiede sia il GFP sia la proteina che voglio esprimere. Io valuto l'efficienza di trasfezione mediante GFP e deduco quindi che il gene della mia proteina é stato trasfettato alla stessa percentuale. Credo che sia normale comunque che l'efficienza di trasfezione cambi in rapporto alla grandezza del costrutto, peró non so a quanto serva il calcolo cosí 'alla lettera' che stai facendo.Magari qualcuno piu esperto di me te lo puo dire. Su che cellule lavori? La trasfezione la fai con lipofectamina o con elettroporazione? |
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cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 25 febbraio 2010 : 14:25:55
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obiezione correttissima! l'ideale infatti sarebbe utilizzare un plasmide che mi esprima sia GFP sia p53, però per esigenze tecniche/economiche io sono costretta ad usare 2 vettori diversi, quindi quando trasfetto per p53 sostanzialmente l'efficienza la valuto a posteriori e in modo del tutto aprossimativo facendo il western per la proteina.
io trasfetto con il fugene, e le mie cellule sono le H295r, il discorso del calcolo che volevo fare era per fare una comparazione della concentrazione dei miei 2 plasmidi come molarità piuttosto che come peso/volume, dato che presumo che plasmidi di dimensioni molto diverse abbiano pesi diversi... in realtà magari non cambia niente, ma io vorrei ricreare le condizioni più simili possibile tra i miei esperimenti (dato che già uso vettori diversi...) e mi chiedevo se farlo abbia davvero un senso oppure è solo una perdita di tempo che non cambia l'esito dell'esperimento... |
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2010 : 12:24:51
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| Ma nn puoi insertare p53 in pEGFP? Di norma sei tua doverlo fare questo perche il plasmide commerciale possiede solo EGFP. Il plasmide che sta usando per p53 non ha un controllo? Misurare l'efficienza di trasfezione con un western non mi sembra una grande idea..perché se il western é negativo non ti dice molto sull'efficienza di trasfezione.Se il western é negativo non puoi affermare che le cellule non sono state trasfettate. E poi se a questo aggiungi il problema che hai con gli anticorpi.Ma qual'é il tuo scopo finale? Intendo..non sará di certo misuarare l'efficienza di trasfezione..considera comunque anche che avendo 2 campioni diversi la concentrazione dei 2 plasmidi potrebbe non essere la stessa. Vengono da una maxiprep? l'hai misurata la concentrazione? |
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cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2010 : 13:43:19
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no no, ovviamente il western non mi serve per valutare l'efficienza di trasfezione, ma per vedere se la proteina mi viene effettivamente espressa nel contesto cellulare in cui ho trasfettato il gene. l'efficienza di trasfezione io la dovrei già sapere, perchè ho fatto le prove con la GFP, quello che non so è se io, cambiando plasmide per trasfettare p53, rispetto a quando ho fatto le prove con la GFP, sto utilizzando le stesse condizioni, ovvero: se i miei 2 plasmidi hanno lunghezze diverse, avranno anche un peso diverso? se così è, allora vuol dire che a parità di microgrammi (che io sono in grado di calcolare perchè ho valutato la concentrazione) sto trasfettando più o meno plasmide rispetto al pEGFP, e quindi questo ovviamente mi andrà a influire sull'efficienza di trasfezione. io non voglio valutare l'efficienza della mia trasfezione con p53, voglio mantenere le stesse condizioni che usavo con la GFP anche quando cambio plasmide.. (il concetto di usare plasmidi diversi è imprescindibile, nel mio lab non mi è concesso ordinare plasmidi taggati o fare un clonaggio, è peccato mortale!!)
(comunque il plasmide che uso per p53 ha ovviamente un controllo, ma è il vettore vuoto di p53, non di GFP...) |
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2010 : 14:00:52
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| Ma il plasmide che stai usando per p53 non ha una resistenza che ti permetta perlomeno di selezionare le cellule trasfettate? Non conosco la risposta alla tua domanda ma normalmente quando effettui una trasfezione la fai con 2-3 microl. di plasmide in generale...nessuno fa tutti questi calcoli. Pero davvero non sono in grado di risponderti. |
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cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2010 : 14:14:59
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si, la resistenza ce l'ha, è che normalmente gli esperimenti che faccio rientrano come tempi nelle 72 ore dal trattamento/trasfezione, quindi speravo di potermi accontentare di una transiente... comunque sono d'accordissimo con te sul fatto che finchè non mi viene un western decente non posso dire nulla...
GRAZIE comunque!!!  |
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