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laviadellavirtu
Nuovo Arrivato
51 Messaggi |
 Inserito il - 08 marzo 2010 : 12:37:42
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Ciao a tutti e auguri a tutte le donne!!!
mi servirebbe il vostro aiuto...sono alle prese con la pcr....
La PCR quantitativa ci permette di quantificare un dato templato.
Tutto questo pero'solo se la misura dell'amplicone viene eseguita in fase esponenziale.
Qualcuno saprebbe dirmi come si costruisce un grafico di taratura?
(il testo mi dice.....le quantita di amplificato sono misurate in diversi punti della fase esponenziale ed analizzate mediante regressione lineare...)cosa vuol dire??
aiutatemi ho esame!!!!
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gatto.f
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 11 marzo 2010 : 16:46:28
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beh non è proprio semplicissimo da spiegare, ad ogni modo ci provo:
ogni campione di riferimento ha un contenuto noto di copie di DNA target.
la regressione lineare è tra
- il valore di Ct (threshold cicle), il ct teorico di corrispondente all'intersezione tra la curva di amplificazione (in fase esponenziale) e il threshold (che puoi regolare manualmente e lo imposta automaticamente lo strumento)(sull'asse x)
- il logarutmo del numero di copie (sull'asse y)
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cami
Utente Junior
Città: roma
136 Messaggi |
Inserito il - 12 marzo 2010 : 11:14:55
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in effetti non è semplicissimo da spiegare... comunque il concetto è che in alcuni tipi di analisi per qPCR (v. SYBRgreen), per capire quanto DNA è presente in un campione, lo devi comparare con degli standard a quantità nota, ovvero la tua retta di taratura.
in pratica, la retta di taratura viene costruita utilizzando degli standard con concentrazioni scalari di DNA (es. 10^-4, 10^-5, 10^-6 etc.). Per preparare gli standard di riferimento per il campione da analizzare, bisogna retrotrascrivere l’RNA, e poi produrre un amplicone utilizzando dei primers specifici per il gene (questo si può fare per Real Time PCR o in PCR normale, ma nel caso in cui si effettui una Real Time PCR, questa consente di controllare la curva di melting e quindi di valutare anche la specificità dei primers).
Una volta prodotto l’amplicone, si fa una corsa su gel d’agarosio, al termine della quale dovrebbe essere visibile un’unica banda ben definita. Questa banda deve essere tagliata dal gel e purificata su colonnine, in modo da poter quantificare esattamente il DNA presente.
A partire questo DNA, vengono effettuate delle diluizioni scalari di 1:10 (fino ad arrivare a 10^-9). Le ultime 6 diluizioni (da 10^-4 a 10^-9) verranno quindi utilizzate per creare la retta di taratura, che dovrebbe avere R=1 ed E(efficienza)=1. in questo grafico avrai sull'asse delle x la concentrazione dei tuoi standard, e sull'asse y il Ct. ovviamente, a concentrazioni più alte di DNA corrisponderà un valore di Ct più basso (il segnale esce prima). se la retta viene bene, allora si può utilizzare come riferimento per quantificare i tuoi campioni.
dopo aver fatto la real time sui tuoi campioni quindi, dovrai comparare il Ct dei tuoi campioni con quello degli standard. ad es. se un campione ha un Ct di 21, metti questo punto nel grafico della retta di taratura e vedi che 21 è il Ct del tuo standard diluito, poniamo, 10^-5. a quel punto, se sai che 10^-5 corrisponde a N ng di DNA, saprai che anche nel tuo campione ci saranno N ng di DNA. e via dicendo per tutti i campioni...
questo viene definito come metodo quantitativo, in quanto ti permette di sapere esattamente la quantità di DNA presente in ogni campione. l'alternativa è il metodo semiquantitativo, in cui si costruisce la retta di taratura indicando solo i fattori di diluizione degli standard, ma non le quantità precise di DNA presente. in questo modo, se tu hai 10 campioni da analizzare, potrai valutare se il tuo gene è espresso più o meno in alcuni campioni rispetto ad altri (ad es nel caso di sani/malati, oppure non trattati/trattati), però non sarai in grado di definire quanto DNA è presente in ciascun campione...
spero di esserti stata utile...
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