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fideb
Nuovo Arrivato

DNA
Città: Potenza


54 Messaggi

Inserito il - 09 marzo 2010 : 21:50:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di fideb Invia a fideb un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao!Non riesco a spiegare una piccola incongruenza riscontrata nei risultati delle mie real time-PCR...ho analizzato i livelli di espressione di un gene di insetto nelle ghiandole del veleno, dove è altamente espresso come mi aspettavo, e nelle femmine in toto e nei maschi in toto della stessa specie...preciso che le ghiandole del veleno sono esclusivamente presenti nelle femmine della specie...oltre quindi un elevata espressione nelle ghiandole del veleno, ho trovato una espressione anche nei maschi, la cosa strana è che è superiore a quelle delle femmine in toto e che quella delle femmine in toto non è per nulla paragonabile a quella riscontrata per le ghiandole...come è spiegabile ciò???qualcuno può darmi un aiuto???

domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 10 marzo 2010 : 00:09:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
La butto lì:
Meccanismi post trascrizionali di regolazione...l'mRna è di più ma non viene prodotta la proteina a causa d un miRna che blocca la sintesi.
Puoi confermare i tuoi dati per western blot?

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 10 marzo 2010 : 08:13:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Concordo con domi, mi sembra una spiegazione sensata.

Giusto per confermare tu vedi:

maschi in toto > femmine in toto > ghiandole veleno femmine
giusto?

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 10 marzo 2010 : 11:05:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh io tornerei un attimino indietro e mi assicurerei dei risultati prima di fare ipotesi.
Primo: cosa si sa dalla letteratura di questo gene? Dovrebbe essere un gene espresso solo nelle ghiandole del veleno? oppure è espresso anche da altre parti? (cerca tutta la letteratura in proposito)
Secondo: sei sicurissima della tua real-time? Sicura che amplifichi solo cDNA e non genomico? Sicura che i tuoi housekeeping siano adeguati? Ne utilizzi uno solo o più di uno? ecc...
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fideb
Nuovo Arrivato

DNA

Città: Potenza


54 Messaggi

Inserito il - 10 marzo 2010 : 14:21:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di fideb Invia a fideb un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non è stato fatto alcun western blot perchè non disponiamo ancora dell'anticorpo...cmq i livelli di espressione sono:
ghiandole veleno femmine > maschi in toto > femmine in toto
Circa la letteratura del gene non c'è nulla di pubblicato...è stato da poco isolato e lo si sta caratterizzando nel mio lab...cmq dovrebbe essere un gene espresso in particolare nelle femmine e soprattutto nelle loro ghiandole del veleno...i risultati delle real time sono concordi e confermati da più prove anche di semplice PCR...se nelle ghiandole del veleno femminili il gene è molto espresso come mai poi scompare nelle femmine in toto (comprese di ghiandole)???
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 10 marzo 2010 : 14:52:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
A maggior ragione, sicura che non ci sia un problema di normalizzazione?
Se l'housekeeping non è adeguato ti possono venire risultati incongruenti.
Riguardo al fatto che tu abbia gli stessi risultati con una PCR end-point, non saprei, ma in questo caso le variabili sono molte.

Poi può anche essere che questo gene sia in realtà espresso anche nei maschi.
Se tu hai ad es. una situazione in cui nelle femmine è espresso esclusivamente nelle ghiandole del veleno, mentre nei maschi è espresso a bassi livelli ma in modo ubiquitario potresti ottenere dei risultati del genere. Se analizzi solo le ghiandole del veleno vedi una espressione elevata, nei maschi vedi una certa espressione e nelle femmine in toto ti sembra bassa perchè in altre zone non la esprimono e questo ti abbassa di molto il dato di espressione.
Ovviamente sono solo ipotesi visto che non sappiamo niente di questo gene.

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fideb
Nuovo Arrivato

DNA

Città: Potenza


54 Messaggi

Inserito il - 10 marzo 2010 : 18:20:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di fideb Invia a fideb un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Cosa intendi di preciso per housekeeping inadeguato?Quindi tu dici che nelle femmine in toto la quantità di mRNA del mio gene tenderebbe a diluirsi in un certo senso???ma le copie di partenza di mRNA del mio gene nelle femmine non dovrebbero essere le stesse o di più di quelle delle ghiandole del veleno?
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 10 marzo 2010 : 20:24:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da fideb

Cosa intendi di preciso per housekeeping inadeguato?

L'housekeeping deve essere costante in tutte le condizioni che stai analizzando, se non lo è non puoi quantificare.
Io come ho detto più volte preferisco utilizzare 3 housekeeping e controllo prima che che siano adeguati, prima di iniziare a fare la real-time del gene di interesse.


Citazione:
Messaggio inserito da fideb

Quindi tu dici che nelle femmine in toto la quantità di mRNA del mio gene tenderebbe a diluirsi in un certo senso???ma le copie di partenza di mRNA del mio gene nelle femmine non dovrebbero essere le stesse o di più di quelle delle ghiandole del veleno?


No io dico che se nelle femmine l'espressione è 100 nelle ghiandole e 0 nel resto, se tu analizzi solo le ghiandole vedi un valore di 100 se analizzi la femmina in toto questo 100 è suddiviso su tutto l'RNA totale e quindi è meno, non so sono stata più chiara.
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fideb
Nuovo Arrivato

DNA

Città: Potenza


54 Messaggi

Inserito il - 13 marzo 2010 : 15:13:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di fideb Invia a fideb un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
L'housekeeping usato è costante, solo che nelle ghiandole risulta più espresso il mio gene di interesse che l'housekeeping...quindi ho un deltaCt negativo...per il resto ho capito cosa intendi...ancora però nn riesco a capire quale funzione specifica ubiquitaria possa avere nei maschi...cmq grazie mille a tutti per l'aiuto!
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