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ale_09_86
Nuovo Arrivato

Prov.: ct
Città: catania


4 Messaggi

Inserito il - 11 marzo 2010 : 09:42:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ale_09_86 Invia a ale_09_86 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti, ragazzi qualcuno gentilmente saprebbe dirmi perchè per clonare un frammento di cDNA in un vettore pQE30 devo prima clonarlo in TOPO-TA.
Vi ringrazio infinitamente, alessandro.........

domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1700 Messaggi

Inserito il - 11 marzo 2010 : 10:56:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando

Io ho fatto clonaggi in pQE30....ma non l'ho clonato prima in TOPO-TA (cos'è?!)

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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Schuldiner86
Utente Junior

Biotech

Prov.: Viterbo
Città: Bologna


581 Messaggi

Inserito il - 11 marzo 2010 : 11:44:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Schuldiner86  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Schuldiner86  Invia a Schuldiner86 un messaggio Yahoo! Invia a Schuldiner86 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io l'ho usato per la tesi. Praticamente si basa sul fatto che la Taq polimerasi in seguito a una PCR aggiunge sempre un A al 3' dell'amplificato. Il TOPO-TA è un vettore che è linearizzato e presenta alle estremità 5' due topoisomerasi attaccate con un legame Y-P a due T overhanging. Praticamente nel momento in cui metti insieme l'amplificato di PCR con il vettore le A e le T si appaiano e la topoisomerasi catalizza la formazione dei legami fosfodiestere tra vettore ed amplificato. Praticamente il vantaggio è che ti eviti il passaggio della digestione con la conseguente perdita in resa. Quindi il TOPO-TA in genere si usa quando ci stanno problemi per enzimi di restrizione oppure più solitamente quando l'amplificato in PCR non è in quantità grandi. Se si evita la digestione ed il passaggio in colonna per la purificazione si ha più DNA di inserto in partenza, che poi fai amplificare in coli. Spero di essermi spiegato.



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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 11 marzo 2010 : 13:34:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh dovresti dirci meglio dove hai sentito questa cosa e cosa è stato fatto di preciso.
Come ti è stato detto per clonare in pQE30 non è necessario passare prima da TOPO-TA, ma questo sarà stato fatto per esigenze particolari. Senza sapere la strategia di clonaggio però è impossibile risponderti.
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