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vale.mela
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 26 marzo 2010 : 18:53:07
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Ciao a tutti! ho un esamino di farmacologia lunedì e c'è un argomento che non ho seguito a lezione! Come al solito mi riduco sempre all'ultimo momento, non ho il libro e non riesco a trovare nessuna informazione a riguardo!
Qualcuno sa darmi qualche informazione sulle metodiche di studio del Ca++ intracellulare (in particolare la tecnica di immagine in fluorescenza) ???
GRAZIE MILLE!!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 26 marzo 2010 : 21:39:46
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Beh, per la misura del Ca++ intracellulare (Ca2+ imaging) si usano delle sostanze (indicatori) che legano il calcio ed hanno diversa fluorescenza a seconda che siano legate o meno al calcio.
Esistono 2 tipi di indicatori:
a) delle molecole inorganiche, analoghi del BAPTA (un chelante del calcio) come il Fura-2, l'Oregon Green l'Indo-1. Questi indicatori vanno "caricati" nelle cellule, semplicemente incubandole in una soluzione dell'indicatore. A volte (specialmente se si vuole far andare l'indicatore in un tessuto e non in cellule in coltura) si possono usare degli adiuvanti come l'acido pluronico, che facilita l'entrata dell'indicatore nelle cellule.
Generalmente si usano delle varianti esterificate di questi composti (es. Fura-2 AM) che passano più facilmente le membrane cellulari. L'estere viene poi scisso dalle esterasi cellulari.
b) delle proteine come Pericam e Cameleon che possono essere espresse come transgeni nella cellula. Esistono anche topi transgenici che le esprimono. Generalmente sono varianti della GFP fuse con un dominio calmodulina.
Gli indicatori possono essere diretti o ratiometrici. I primi cambiano fluorescenza in funzione della [Ca2+] (es. tanto calcio tanta fluo, poco calcio poca fluo).
Gli indicatori ratiometrici invece hanno uno spettro di eccitazione e/o emissione diverso a seconda che siano legati o meno al Ca2+. Quindi in questo caso vai a vedere il rapporto (ratio in inglese, da cui il nome) tra la fluorescenza della forma legata al calcio e quella della forma non legata.
Conta che questo è proprio un mini-mini-sunto, ci si potrebbe scrivere un'enciclopedia a proposito! |
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vale.mela
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 28 marzo 2010 : 10:52:42
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Il mini-mini-sunto va benissimo!! mi basta avere chiaro il concetto!
ti ringrazio per l'aiuto! |
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mughetto
Nuovo Arrivato
16 Messaggi |
Inserito il - 28 marzo 2010 : 15:26:38
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Guarda io durante la tesi triennale ho utilizzato dei cameleons geneticamente codificati per studiare le variazioni dello ione calcio nei mitocondri delle cellule nervose in risposta a stimolazioni varie. si tratta di proteine chimeriche costituite dalla fusione di due proteine fluorescenti, con interposta la proteina di legame al calcio calmodulina. In seguito al legame del calcio, i due fluorocromi si avvicinano ed aumenta l'efficienza del FRET tra i due fluorocromi: in seguito al FRET, l'emissione del fluorocromo donatore eccitato diminuisce, mentre aumenta quella del fluorocromo accettore. La sonda può presentare sequenze di indirizzamento a specifici organelli subcellulari. in seguito alla trasfezione del DNA codificante per la sonda nelle cellule, è possibile acquisire delle immagini al microscopio confocale e mediante opportuni software risalire all'intensità del segnale fluorescente emesso dai due fluorocromi e da qui risalire alla variazione della concentrazione di calcio. |
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