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valentina72
Nuovo Arrivato
23 Messaggi |
 Inserito il - 05 luglio 2006 : 17:03:06
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posso estrarre RNA?
Come devo procedere prima di utilizzare un kit di estrazione?
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 luglio 2006 : 18:47:58
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Si i campioni in fosiologica non ti danno problemi per l'estrazione dell'RNA, l'importante è che siano stati congelati abbastanza rapidamente perchè l'RNA si degrada facilmente. Altrimenti potresti avere una bassa resa.
Potersti spiegarmi meglio cosa intendi? o meglio che kit usi? normalmente se usi un kit c'è scritto come processare i vari capioni prima dell'estarzione. Per i campioni in fisiologica non ci sono particolari problemi, procedi direttamente alla lisi con la soluzione di lisi presente nel kit. |
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valentina72
Nuovo Arrivato
23 Messaggi |
Inserito il - 05 luglio 2006 : 19:24:59
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Intanto grazie per avermi risposto anche per l'etanolo....
come kit uso un kit della Celbio sia per DNA che per RNA ma non so se far scongelare la biopsia e procedere frammentando con il pestello o fare la stessa operazione senza scongelare..
il congelamento è avvenuto in ghiaccio secco, ora sono a -20°C e non so che fare.... |
Vale |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 06 luglio 2006 : 16:13:35
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Quando congeli i campioni su ghiaccio secco (che va benissimo!) sarebbe meglio farlo a secco, così puoi sminuzzare il tessuto ancora congelato. Se è in liquido risulta più difficile devi eliminare il liquido prima di omogenare il tessuto, quindi devi farlo scongelare senza però lasciarlo troppo a temperatua ambiente (ad es. puoi sgongelare mantenendolo in ghiaccio), eliminare la fisiologica e procedere alla lisi con il Lysis/Binding buffer. Per lisare se hai un omogenizzatore è la cosa migliore altrimenti puoi usare dei pestelli (io faccio così!).
N.B. se usi i pestelli stai attenta a non eccedere con il buffer altrimenti non riesci a lisare il tessuto perchè ti "scappa" nella provetta, è megli metterne poco e poi aggiurgene.
Ambion è buono come kit io lo uso per l'RNA.
Scusa mi è suonato il timer.
Poi ti rispondo anche per l'RNA-later |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 07 luglio 2006 : 09:21:06
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Noi preleviamo parecchi tipi di tessuti che poi andranno all'estrazione dell' RNA, appena tolti dal corpo (sia esso topo, ratto o uomo), vengono lavati con della fisiologica e immediatamente messi in carta stagnola o provette e subito in azoto ( vedi "RNA in etanolo": le RNAsi sono tremende). Non so, o meglio non penso che il
- 20 sia sufficiente, eppoi quanto tempo sono state a - 20? Pensa che campioni di cDNA che teniamo a -20 si degradano anch'essi dopo un pò di tempo, figurarsi l'RNA.
Dopo il passaggio in azoto i pezzi vengono conservati a -80.
Per l'estrazione usiamo il kit della Qiagen (secondo me e dopo opportune prove, posso dirti che è il migliore!).
Il pezzo ancora congelato (NON FARLO SCONGELARE ASSOLUTAMENTE FINCHE' NON E' IN UN BUFFER DI LISI O CONSERVANTE!!!!!), viene messo in Qiazol (che se vogliamo è una specie di RNAlater, serve sia a lisare le cellule che a conservare l'RNA, è della Qiagen e si compra a parte)e quindi potterizzato.
Considera che la maggior parte dei tessuti si frulla bene, per quelli un pò rognosi come il muscolo basta avere un po' di pazienza. Se hai più campioni ricorda di lavare bene la fresa tra un campione ed un altro per evitare errori di trascinamento di campione.
Usiamo precedentemente il pestello solo per l'osso, ma è un gran casino, perchè bisogna che tutte le manovre vengano effettuate con l'azoto liquido, difatti sono più i mortai che si spaccano dei campioni che riusciamo a pestellare.
Ma infine ti dico come nell'altra discussione che è meglio analizzarli all'Agilent. |
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tessuti in fisiologica a -20°C
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