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 isolamento proteine idrofobiche
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SMO
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11 Messaggi

Inserito il - 06 aprile 2010 : 10:47:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SMO Invia a SMO un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti...:-)

devo identificare dele proteine idrofobiche da un eluito di una cromatografia per affinità
(ho un peptide e cercho il suo ligando)
correndo l'eluito in sds page riesco a fare la massa (spettrometro), di alcune proteine, ma non di quelle idrofobiche.

qualcuno di voi per caso conosce qualche metodo che mi permetta di "purificare" le proteine idrofobiche permettendomi di averne una quantità adatta per poterle identificare con lo spettrometro di massa???

spero mi possiate dare una mano.... :-)

metionina
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Città: Cambridge


45 Messaggi

Inserito il - 13 aprile 2010 : 23:37:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di metionina Invia a metionina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao!

anch'io lavoro con una proteina idrofobica e i problemi sono sempre molti!
non capisco una cosa, ma le vedi su sds-page queste proteine idrofobiche? o tutte le bande che vedi su sds-page le identifichi come proteine solubili con lo spettrometro di massa?
sono proteine inserite in membrana?
e cosa carichi sulla colonna di cromatografia?
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SMO
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11 Messaggi

Inserito il - 14 aprile 2010 : 21:26:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SMO Invia a SMO un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao :-)
carico un lisato cellulare..e tt le bande "tagliabili" lo spettrometro me le identifica cm proteine solubili oppure mi "dice" che nn c'è "abbastanza materiale"...
come posso fare secondo te??
:-)
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metionina
Nuovo Arrivato

Città: Cambridge


45 Messaggi

Inserito il - 15 aprile 2010 : 23:16:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di metionina Invia a metionina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ti do delle idee forse un po' stupide, immagino che tu ci abbia già pensato, ma provo comunque!
Le proteine membranali restano in teoria nei corpi di inclusione dopo lisi cellulare, ma spesso restano anche numerose nei detriti insolubili. Hai provato a caricare anche quelli sulla tua colonna? L'isolamento di proteine idrofobiche necessita sempre l'uso di detergenti in ogni fase per evitare che le proteine si aggreghino e precipitino. Hai provato a usare dei detergenti nella tua fase di eluizioni dalla colonna? La proteina che cerchi sai quanto è grande? Perchè spesso le proteine idrofobiche migrano su gel più basse rispetto alla loro taglia attesa. Tienlo presente quando tagli su gel. Un'altra cosa, forse sempre banale, è meglio non bollire i campioni prima di caricarli su gel SDS-page perchè i legami idrofobici si rompono e le proteine tendono a aggregare, a precitare e a restare nel pozzetto.
A me hanno detto che a priori le proteine idrofobiche possono essere determinate tagliando la banda da gel e facendo un maildi-tof come le proteine solubili, bè, la mia proteina è molto piccola e molto idrofobica, e non l'ho mai identificata con questa tecnica...
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SMO
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11 Messaggi

Inserito il - 19 aprile 2010 : 20:33:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SMO Invia a SMO un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie mille dei consigli metionina :-)
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