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Limpet
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Prov.: Roma
Città: Roma


83 Messaggi

Inserito il - 09 aprile 2010 : 21:12:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Limpet Invia a Limpet un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti,

devo mandare sequenza diretta di un prodotto di pcr (senza passare per il clonaggio) utilizzando il kit di sequenza dell'applyed. Mi accorgo che faccio tutto in automatico, senza effettivamente capire "cosa faccio", anche se funziona, usando un protocollo che utilizzavo in un altro lab.
In pratica, eluisco il mio prodotto di pcr, lo quantizzo su gel, considero le giuste quantità da utilizzare per mandare reazione di sequenza (bp frammento quant in ng) e preparo la mia reazione di sequenza: eluato (template), Mix (del kit), H2O,Primer (F o R) 1,6 micromol e via di reazione!
Precipito le sequenze, aggiugo formammide, denaturo a 96°C per 10 min e vado al sequenziatore....

Mò, per quanto ho capito, il sequenziamento di DNA con tecnologia capillare dà risultati migliori rispetto a quello su gel, ma richiede un campione molto più pulito, quindi si utilizzano kit di sequenza, ma all'atto pratico, che succede? "pulisco" dal gel e da sali, taq della pcr, precipito, denaturo pronta a sequenziare?
Che fa questo kit esattamente?quale dei metodi sto utilizzando per sequenziare...enzimatico?
mi sento 'mpò gnurant,
grazie a tutti,

ogni parola è apprezzata
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