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 Pcr con oligo con siti di restr e poi?
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Morfeo
Nuovo Arrivato

Città: Roma


110 Messaggi

Inserito il - 10 aprile 2010 : 20:09:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Morfeo Invia a Morfeo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti. Sto studiando clonaggi, pcr e come disegnare primer (e alcune cose le faccio anche in lab). Avrei una domanda, mettiamo che io faccia un pcr utilizzando dei primer foward e reverse con siti di restrizione alle code in modo che poi taglierò sia il plasmide che il frammento con gli stessi enzimi e farò una ligazione per avre il mio costrutto. Ecco, dopo aver fatto la pcr ed elettroforesi su gel di agarosio mi immagino che osserverò varie bande tra cui quelle dei primer non appaiati e quelle del mio amplificato. Però teoricamente dovrei osservare anche delle bande corrispondenti al mio Dna stampo di origine (senza siti di restrizione quindi)no?, inoltre come faccio ad avere il mio frammento amplificato con i siti di restrizione inclusi "puro"?, forse lo estraggo direttamente dal gel? Se avete delle spiegazioni, perchè di questa cosa mai me ne hanno parlato ne l'ho fatta personalmente.Grazie a tutti!

mak_steon
Utente Junior



138 Messaggi

Inserito il - 12 aprile 2010 : 09:25:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mak_steon Invia a mak_steon un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io non ho mai fatto clonaggi però ti posso rispondere ad alcune domande.
La banda dei primer non appaiati non la dovresti vedere perchè troppo piccola;
le bande corrispondenti al DNA stampo di origine sono talmente poche, rispetto ai miliardi di copie con i siti di restrizione, che non influiscono assolutamente, è come se fosse "puro";
quando vai a tagliare enzimaticamente quindi non dovresti quindi avere problemi (per questo comunque è meglio avere conferma da qualcuno che ha fatto clonaggi perchè magari mi sfugge qualcosa).

Ciao
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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1700 Messaggi

Inserito il - 12 aprile 2010 : 10:37:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
La banda dei primer non appaiati non la dovresti vedere perchè troppo piccola;

A meno che non metti un grosso eccesso di primer...

Per quanto riguarda la pcr "pura" (come la chiami tu) puoi sia correrla sul gel ed estrarti la banda di interessa, sia purificarla direttamente con vari kit tanto lo stampo iniziale è pochissimo. Io preferisco la prima soluzione...

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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Morfeo
Nuovo Arrivato

Città: Roma


110 Messaggi

Inserito il - 12 aprile 2010 : 20:20:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Morfeo Invia a Morfeo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ci ero arrivato infatti poi al fatto che il rapporto stampo originale/prodotto di pcr è così basso che praticamente è come se fosse pura, grazie mille per le risposte e conferme!
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