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 cDNA che non funziona...come controllare??
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superilala
Nuovo Arrivato


Città: Rotterdam


30 Messaggi

Inserito il - 13 aprile 2010 : 09:21:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di superilala Invia a superilala un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Allora il mio problema è il seguente:ho prodotto dei cDNA da cellule umane (U2Os) ed ho provato una PCR di controllo ma non ho ottenuto nessun amplificato. Lo scopo di tutto ciò sarebbe valutare l'effcienza di siRNA sul mio gene d'interesse con una real time PCR.
Ho fatto ovviamente dei controlli:
- ho controllato l'RNA con un nanodrop e la qualità è buona
- durante la reazione di RT PCR ho usato un RNA che aveva precedentemente funzionato come controllo positivo
-durante la reazione di PCR ho usato un plasmide codificante il gene d'interesse come controllo positivo per la PCR
Ora nella mia PCR di controllo ho ottenuto amplificato solamente dal plasmide..ma nessuno dei cDNA ha funzionato...
Come faccio a controllare cosa è andato storto?
Ogni suggerimento è molto ben accetto!
Grazie
Ilaria

SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 14 aprile 2010 : 18:07:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scusa la domanda, ma sei sicura che nelle cellule il tuo gene sia espresso? Potrebbe anche essere presente in pochissime copie per cellula...
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Laracroftit
Nuovo Arrivato

arabidopsis

Città: Sassari


37 Messaggi

Inserito il - 14 aprile 2010 : 19:07:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Laracroftit  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Laracroftit Invia a Laracroftit un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io di solito prima di fare la PCR per il mio gene di interesse ne faccio una per un gene costitutivo (actina per esempio), che son sicura che e' espresso nel mio campione :-)

"I want to know God's thoughts...
...the rest are details."
(Albert Einstein)
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superilala
Nuovo Arrivato


Città: Rotterdam


30 Messaggi

Inserito il - 14 aprile 2010 : 20:51:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di superilala Invia a superilala un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer

Scusa la domanda, ma sei sicura che nelle cellule il tuo gene sia espresso? Potrebbe anche essere presente in pochissime copie per cellula...




Si ho controllato via western blot e la proteina c'è!
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superilala
Nuovo Arrivato


Città: Rotterdam


30 Messaggi

Inserito il - 14 aprile 2010 : 20:53:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di superilala Invia a superilala un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Laracroftit

Io di solito prima di fare la PCR per il mio gene di interesse ne faccio una per un gene costitutivo (actina per esempio), che son sicura che e' espresso nel mio campione :-)





...ehhh..l'ho fatto! Nella mia PCR ho usato anche dei primer per la GAPDH...ma niente..nemmeno quelli hanno funzionato...ogi ho provato a fare la PCR con una temperatura iniziale di denaturazione di 97 invece che 95 e domani la corro...spriamo che funzioni!
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superilala
Nuovo Arrivato


Città: Rotterdam


30 Messaggi

Inserito il - 16 aprile 2010 : 13:05:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di superilala Invia a superilala un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
UPDATE: ..la PCR non ha funzionato di nuovo...che cos'altro posso tentare???
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 16 aprile 2010 : 13:27:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Solo una domanda: l'RNA che hai utilizzato di controllo
Citazione:
Messaggio inserito da superilala

- durante la reazione di RT PCR ho usato un RNA che aveva precedentemente funzionato come controllo positivo

aveva funzionato con i primers che stai utilizzando adesso?

A quanto ho capito la PCR viene solo dal plasmide e non dal cDNA, sia dei campioni che del controllo.
Se è così io più che fare prove sulla PCR ripeterei la retrotrascrizione, se le cose stanno così sembra che il problema sia nella retrotrascrizione non nella PCR.
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superilala
Nuovo Arrivato


Città: Rotterdam


30 Messaggi

Inserito il - 16 aprile 2010 : 16:58:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di superilala Invia a superilala un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Cara GFPina,
si l'RNA che ho utilizzato aveva funzionato con gli stessi primer...e si, la PCR viene solo sul plasmide e non sui cDNA..anche io sospettavo della retrotrascrizione ma il dubbio mi viene dal fatto che nella PCR ho inserito anche un cDNA precedentemente prodotto che aveva giá funzionato dando una bellissima singola banda...quindi in teoria il problema é nella PCR...ma sinceramente la cosa é cosí ingarbugliata che forse faccio prima a cominciare tutto da capo...
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 16 aprile 2010 : 17:39:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh ma se fosse un problema di PCR perchè avrebbe funzionato sul plasmide?

Ho escluso le altre possibilità che mi sono venute in mente perchè hai detto che precedentemente ha funzionato, ovviamente immagino che tu non abbia cambiato niente.

In ogni caso secondo me riprovare a fare la retrotrascrizione a questo punto conviene.
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bioalex20
Nuovo Arrivato



9 Messaggi

Inserito il - 19 aprile 2010 : 17:35:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di bioalex20 Invia a bioalex20 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
In effetti se neppure il controllo di Retrotrascrizione (cioè l'RNA di controllo e venuto in precedenza che hai retrotrascritto) è venuto, significa che c'è stato qualche problema proprio nella reazione di RT.

Se poi hai già escluso che il problema sia ancora più a monte controllando la qualità dell'RNA, il fatto che i primer siano inseriti in sequenza codificante e che il tuo trascritto d'interesse sia espresso, direi che sei abbastanza sicura che il problema sia proprio lì.

A questo punto bisogna solo definire se il problema è definito da qualche reagente o dallo strumento con cui hai effettuato la retrotrascrizione.

Buona ricerca! ^^

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