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primrose
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9 Messaggi

Inserito il - 13 aprile 2010 : 19:21:53

Ciao a tutti, ho un problema con un esperimento di 5'RACE che non riesco a riprodurre

vi spiego brevemente la situazione.
Un primo tentativo mi ha permesso di ottenere delle bande nette dopo una sola nested-PCR. ho sequenziato i prodotti di questa amplificazione e mi sono accertata che si trattasse di prodotti specifici.
Tuttavia, partendo dall'RNA di un altro differenziamento, pur usando gli stessi oligo sia per retrotrascrivere che per le varie amplificazioni, ottengo solo degli smear.

Ho già fatto parecchi controlli :
- ho cambiato la temperatura di annealing dei primer
- ho proceduto con più di una nested-PCR
- ho sottoposto a tailing una quantità maggiore di templato
- ho ridiluito gli oligo
- ho provato ad amplificare con diverse polimerasi
Qualcuno mi sa dare qualche suggerimento?